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细胞破碎技术的基本概念及其基本方法-3

2020.9.14

（6）冻结-融化法

将细胞放在低温（-150C），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。

（7）干燥法

经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。

破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y(%)=[(N0-N)/N0]×100
N0－原始细胞数量

N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量

目前N0和N主要通过下面的方法获得：直接计数法在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。

间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。

在众多的细胞破碎方法中高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。在具有特异结合甘露糖基的雪花莲外源凝集素 (Galanthusnivalisagglutinin,GNA)具有多种生物活性 ,在糖蛋白分离、逆转录病毒病和害虫防治等方面有广泛的应用价值。该试验分别采用超声破碎法、冻融裂解法和溶菌酶法破碎重组大肠杆菌细胞后 ,经尿素或SKL(十二烷基肌氨酸钠水溶液 )溶解后 ,再透析复性获得了在大肠杆菌 (E .coli)中高效表达的重组GNA蛋白 ,并经SDS -PAGE电泳检测GNA的大小、浓度及表达量。通过对诱导表达时间、超声处理的功率、时间、模式、尿素和SKL洗涤浓度 ,透析条件的优化组合 ,建立了一套从大肠杆菌细胞中分离重组GNA蛋白的有效方法 ,为进一步的重组GNA生物活性试验提供了物质基础。

破碎方法的选择对于破碎结果和破碎的质量有很大的影响。方法的选择依据一般主要有（１）处理量

（２）产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置

（３）生化物质的稳定性

（４）细胞的数量和细胞壁的强度

（５）破碎程度

（６）提取分离的难易。适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行考滤。抗氧化剂对根瘤土壤杆菌细胞破碎的研究中考察了研磨法、有机溶剂法和超声波破碎法对根瘤土壤杆菌细胞破碎的影响。结果表明，在有机溶剂破碎条件下，最佳搅拌时间为3．5h，此时CoQ10的含量为 5．703mg／L；由正交实验分析得出，菌体浓度为40mg／mL，作用时间为12min，破碎功率为250W时，超声波破碎的效果最佳；与上述两种常规破碎方法比较，在研磨的条件下，加入抗氧化剂BHT（2，6-二叔丁基对甲酚）的细胞破碎效果最好，CoQ10的含量为8．012mg／L，比不加抗氧化剂BHT研磨时提高了约38％，抗氧化剂BHT的最佳质量分数为20％。

细胞破碎技术广泛应用于各个领域之中，全面系统的认识细胞破碎技术对于生产实践有着更深远的意义。基因工程近几年发展更是迅速，更好的选择细胞破碎技术对于基因工程的研究有很大的帮助。医学中新产品的发现造福于人类。工农业中对提高生产质量有不可估量的潜在作用。

（1）《生物技术通报》　１９９１年０８期

（2）《生物技术》　　　1997年05期

（3）《生物技术》 2004年02期

（4）《酿酒科技》 2006[11]21-23

（5）《北京化工大学报：自然科学版》 06年33卷第5期

（7）《生物工程下游技术》