流式细胞仪的基本结构组成

2018年7月13日 13:36:11 来源: 互联网
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流式细胞仪主要是由流动室和液流系统;激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统四部分组成。

1.流动室和液流系统。流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动。

2.激光源和光学系统。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是zui常用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线zui强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550~650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效率zui高,约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定:d=4λf/πD。λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开。

3.光电管和检测系统。经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)zui为常用。PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ,因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定,工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;zui大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同,不宜互换。也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比PMT好。从PMT输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例DNA测量等。另一类是对数放大器,输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1~2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

4.计算机和分析系统。经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,zui后给出结果。除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气体等附加装置。


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