聚丙烯酰胺凝胶电泳原理特性和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电...-3
2．分子筛效应
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。
经上述浓缩效应后，快、慢离子及蛋白质均进入pH8.9的同一孔径的分离胶中。此时，高电压消失，在均一的电压梯度下，由于甘氨酸解离度增加，加之其分子量小，则有效泳动率增加，赶上并超过各种血清蛋白。因此，各种血清蛋白进入同一孔径的小孔胶时，则分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关，分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于凝胶柱色谱中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。
3．电荷效应
虽然各种血清蛋白在浓缩胶与分离胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭窄的高浓度蛋白区，但进入pH8.9的分离胶中，各种血清蛋白所带净电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个圆盘状的区带，因而称为圆盘电泳。
目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性，而常为科学工作者所采纳。
聚丙烯酰胺垂直板电泳是在圆盘电泳的基础上建立的，两者电泳原理完全相同，只是灌胶的方式不同，凝胶不是灌在玻璃管中，而是灌在嵌入橡胶框凹槽中长度不同的2块平行玻璃板的间隙内。且间隙可调节，一般有0.5mm，1.5mm及3mm
3种规格的橡胶框，前2种多用于分析鉴定，后一种常用于制备。垂直板电泳较圆盘电泳有更多的优越性：
（1）表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。
（2）在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。
（3）胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。
（4）胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。
（5）可进行双向电泳
血清蛋白在纸或醋酸纤维薄膜电泳中，只能分离出5~6条区带，而上述2种形式的聚丙烯酰电泳却可分离出数十条区带，因而，目前PAGE已广泛用于科研、农、医及临床诊断的分析、制备，如蛋白质、酶、核酸、血清蛋白、脂蛋白的分离及病毒、细菌提取液的分离等。
三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用它所形成孔径不同引起的分子筛效应，可将蛋白质分开。也可在整个电泳体系加入十二烷基硫酸钠（sodium
dodecyl sμlfate简称SDS），则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS-PAGE。
用SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理：SDS是阴离去污剂，在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与大多数蛋白质平均结合比为1.4g
SDS/1g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4g
SDS/1g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打断，因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述2种情况，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数有关。
进行SDS-PAGE时，可利用已知分子量蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。用此法测定蛋白质分子量具有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少（仅需一天），分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质分子量测定，还可用于蛋白质混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。
