利用光遗传方法在FLIPRT ETRA系统上对Cav1.3通道的研究—2
结果
通过ChR2调控Vm
通过用FLIPR膜电位染料孵育ChR2转染的HEK-293细胞，验证了光激活ChR2对膜电位的调控。由FLIPRTETRA系统LED发出的蓝光脉冲导致膜去极化，而FLIPR膜电位染料的信号增加了3倍(图3a)。随着时间的推移，膜电位信号的记录显示，当细胞膜重新极化时，从最初的蓝光刺激到大约30分钟后，荧光信号返回到背景水平。这一数据表明，当蓝色光刺激ChR2打开时，Vm首先被去极化，随着时间的推移，随着ChR2通道关闭Vm重新极化(图3b)，它的时间常数为6.9分钟。
ChR2诱导的Cav1.3反应
转染的HEK-293细胞与FLIPR钙6染料孵育。随着钙离子进入细胞(图4A)，蓝色发光二极管发出的光脉冲触发了荧光信号的增加。随后的实验(图4B)中，使用双脉冲检测方案的细胞来识别Cav1.3通道从失活状态恢复的时间依赖性。10分钟间隔后，记录到了原始钙流一半的信号。45分钟间隔后，几乎100%的信号被记录下来。数据显示，在第一次光脉冲10分钟后，一半的通道仍处于失活状态，从而产生50%的最大钙信号。
钾离子的调控
用K+调控Cav1.3通道的状态，转染HEK-293细胞系中加载FLIPR钙6染在37°C下孵育一小时，添加缓冲液增加钾离子浓度从4mM到75mM以形成不同的膜电位(Vm)。然后在FLIPRTETRA系统中检测钙信号时添加75mM的高浓度K+。代表性的钙信号响应如图5A所示。K+依赖的失活曲线展示了与K+浓度对应的FLIPR钙6染料信号，数据显示诱发的50%最大Ca2+信号的钾离子浓度是22mM(图5B)，这表明在添加了此浓度的钾离子条件下有一半的Cav1.3通道处于失活状态。
药理学
依拉地平是一种抗高血压药物，它也可能有助于减缓帕金森疾病症状的发展，因其对Cav1.3的状态依赖性影响而被选为这项研究的对象。采用ChR2的光遗传学检测方案，表达了Cav1.3的HEK-293细胞在添加不同浓度依拉地平的情况下，用FLIPR钙6染料在37°C下孵育一小时。在FLIPRTETRA系统上采用蓝色光脉冲进行刺激，检测到通道关闭状态下钙流荧光信号的强度的增加。10分钟后，给予了第二次蓝色光脉冲刺激，记录到了通道失活状态下钙流荧光信号的变化。仅观察到原始钙流信号一半强度的荧光信号。在图6A中，结果显示为Cav1.3通道效应的%。高K+调控方案记录的依拉地平的IC50曲线如图6B所示。在较早的钾离子调控实验基础上，将4mMK+或22mMK+添加到FLIPR钙6染料的加载缓冲液中，分别诱导关闭和失活状态。在FLIPRTETRA系统中检测钙信号时添加了75mMK+。膜片钳方法下检测的Cav1.3通道关闭和失活状态下依拉地平的IC50曲线如图6C所示。
总结
包括膜片钳结果在内的所有Cav1.3通道关闭和失活状态下依拉地平的IC50值得比较如表1所示。与关闭状态下的值相比，所有检测方法下得到的在失活状态下的IC50值的左移大约为10倍。这很重要，因为对离子通道的复合效应在通道关闭和失活状态下可能具有不同的临床意义。通过光遗传学检测方案，IC50值更接近于以电生理方法获得的IC50值。光遗传学所获得的“阻断比例”值与电生理学方法所获得的值高度相似，从而提示其高生物相关性。与电生理学不同的是，光遗传学检测中的细胞在实验结束时完好无损。此外，光驱动的光遗传检测是可逆的，这是灵活的分析方法的一个非常理想的特性。
致谢
实验工作和数据数据由意大利米兰的AxxamS.p.A提供。
参考文献
1.Koschak,A.,etal,J.Biol.Chem.2001,276:22100-22106.
2.Prigge,M.,Rossler,A.,Heggeman,P.,Channels.2010,May/June,4:3,241-247.
3.Berndt,A.,Yizhar,O.,Gunaydin,L.,Hegemann,P.,Deisseroth,K.,NatNeurosci.2009,Feb;12(2):229-234.
4.CatterallWA,Perez-ReyesE,SnutchTP,StriessnigJ.PharmacolRev.2005Dec;57(4):411-25.
