利用光遗传方法在FLIPRT ETRA系统上对Cav1.3通道的研究—1
介绍
Cav1.3是一种L型电压门控钙通道，是药物发现的重要治疗靶点。有研究表明，一些药物对Cav1.3通道产生了状态依赖性的效应1，这意味着这些药物的效应随着膜电位的变化(Vm)以及随之而来的通道状态的改变(开放、关闭、失活)而发生变化。由于这可能为病理上过度激活的Cav1.3通道提供了高度期望的选择性，因此，对高通量分析方法的开发需求日益增长，以评估通道阻断剂的不同状态下的效应。
目前的筛选方法采用电生理学或荧光法，利用钾离子来调节膜电位，但两种方法都有很大的局限性。电生理学直接控制Vm，但它是侵入性的且并不是很适合高通量的检测分析模式，而荧光测定法则具有较差的生理相关性，而且是不可逆的。
为了解决这些局限性，我们在这里报告了一种新的解决方案，它利用光遗传学方法通过光敏感通道-2(channelrhodopsin-2，ChR2)2来控制Vm。ChR2是一种光门控机制的非选择性阳离子通道，主要用于通透钠离子(Na+)。当通过蓝光(470nm)激活时，ChR2介导Na+的流入，从而延长了膜的去极化，使Cav1.3通道首先进入开放状态，然后逐渐进入失活状态。在光激活终止后，膜电位再极化，这将使Cav1.3通道回到它的静息状态。在这项研究中,我们将使用FLIPR系统展示一种光遗传学方法的新应用来控制Vm，进行可逆且精确的方式来筛选状态依赖性钙通道阻断剂。
材料
- HEK-293细胞系联合表达ChR2D156A(来源于莱茵衣藻)，人源的Cav1.3α1+α2δ,Β亚基，以及人源的Kir2.3是由意大利米兰的AxxamS.p.A提供。Kir2.3的表达首先将Vm设置为超极化值，在全反式视网膜辅因子存在的情况下，它可以对胞外高钾离子(作用于Kir2.3)，或蓝色光刺激的ChR2进行去极化。在这两种情况下，去极化的Vm都会导致Cav1.3打开，允许钙进入细胞。
- FLIPRTETRA系统(0310-5147),FLIPR®钙6检测试剂盒(R8190)和FLIPR®膜电位检测试剂盒(R8042)，均来自于都从Molecular Devices公司。
优势
- 通过光的应用，开发出靶向特异性和非侵入性的检测方法。
- 灵活的、可逆的检测方案
- 数据质量达到电生理以及钾离子刺激等方法检测的标准
方法
光遗传学的一个强大应用是利用光敏驱动器控制Vm。在本研究中，C.reinhardtii的光敏ChR2蛋白被用于控制Vm，作为对状态依赖性Cav1.3阻断剂的高通量分析检测的基础。具体地说，ChR2D156A突变体在FLIPR Tetra系统上被其LED所发出的蓝光(470nm)激活，这使得由于其对Na+的渗透性和开放状态下约为6.9分钟的延长的时间常数3，导致了一种超强的且被延长的膜去极化。由于Vm的去极化，Cav1.3通道首先打开允许Ca2+离子进入细胞，(图1)，并随着时间的推移进入失活状态(图2)。使用FLIPR钙6检测试剂盒观察细胞内钙离子的动态变化。
用ChR2控制Vm
作为验证Vm控制的第一步，用FLIPR膜电位染料(Ex530nm/Em565nm)测量荧光信号的变化，这是Vm变化的结果。HEK-293细胞经ChR2、Kir2.3、Cav1.3转染后，在全反式视网膜辅因子存在的情况下，按照标准流程FLIPR膜电位染料孵育。利用FLIPRTETRA系统，利用蓝色发光二极管的光脉冲刺激ChR2通道来诱导膜去极化。第二种方案是同时进行的，它能激发膜电位染料，并随着时间的推移测量荧光发射的变化。荧光信号的增加反映了膜的去极化。在第一次蓝光刺激结束后，ChR2通道进入关闭状态，允许Vm重新极化，从而导致荧光信号随时间减少。
ChR2对Cav1.3的控制
HEK-293细胞经ChR2、Kir2.3、Cav1.3转染后，首先在全反式视网膜辅因子存在的情况下，加入了FLIPR钙6染料进行孵育。使用FLIPR Tetra系统，细胞用蓝光脉冲刺激ChR2，而荧光的变化则通过Cav1.3反映钙进入细胞。在随后的实验中，使用了双脉冲刺激方案，在第一次脉冲后，第二次光脉冲在第一次脉冲后应用于失活的Cav1.3恢复。
高钾条件下对Cav1.3的调控
作为参考，在同一细胞系上进行了高钾条件下分析Cav1.3通道活性的标准方法。当高钾离子被添加到细胞外液中时，膜电位去极化使得Cav1.3通道打开，钙离子进入细胞(图1)。随着时间的推移，Cav1.3进入失活的非导电状态。用FLIPR钙6染料测量细胞内钙的增加。该方法要求高浓度的K+对非生理的细胞具有许多“非靶向”效应。此外，这种应用是不可逆转的，因为钾离子不能从孔板中去除。
药理学
为了验证光遗传学在药理学实验中的效用，一组实验采用了状态依赖性抑制剂依拉地平来阻断Cav1.3通道，并在关闭和失活状态下分析IC50的结果。三种方法激活Cav1.3通道，包括光遗传学、基于Kir2.3的高钾添加、和膜片钳检测方法，比较两种状态下的依拉地平的IC50值。
