条件性恐惧实验-毛冬青改善血管性痴呆小鼠学...（一）
条件性恐惧实验-毛冬青改善血管性痴呆小鼠学习记忆作用的研究
摘要:
目的:观察毛冬青提取物对血管性痴呆(V D)模型小鼠学习记忆能力的影响，探讨其潜在的作用机制。
方法:采用反复夹闭、再通双侧颈总动脉同时尾静脉放血的方法制备小鼠痴呆模型，随后将小鼠随机分为假手术组，模型组，尼莫地平对照组(30mg/kg)，毛冬青低、中、高剂量组(5, 10, 20 g/kg)，各组灌胃相应药物10 mL/kg，连续35 d，从第30天开始进行行为学检测，末次给药后收集大脑样本，HE染色观察病理学变化、免疫组化法及W esten Blot法检测Bcl-2/Bax蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组小鼠的恐惧记忆时间明显缩短，大脑海马区神经元细胞病变严重，海马区Bcl-2/Bax蛋白表达的比值降低，且主要分布于胞质。与模型组比较，各药物组小鼠的恐惧记忆时间明显延长，大脑海马区的组织病变情况改善，且海马区Bcl-2/Bax蛋白表达的比值显著增加。
结论:毛冬青提取物可能通过上调Bcl-2蛋白表达，下调B ax蛋白表达，减少细胞凋亡，保护神经细胞，从而改善血管性痴呆小鼠的学习记忆功能。
关键词:毛冬青提取物;血管性痴呆;学习记忆能力;细胞凋亡
随着全球老龄化的出现，慢性疾病痴呆越来越引起人们的关注。其中，血管性痴呆是继阿尔茨海默病之后诱发老年期痴呆的第二大病因Czl，也是目前唯一可以预防的脑退化疾病类型。因此，研发有效预防及治疗VD的药物具有重要的意义。毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青的干燥根或叶，是我国南方常用中药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒等功效，大量研究表明，毛冬青的各类制剂对冠心病、脑血栓、血栓性脉管炎等心脑血管疾病均有显著疗效。本研究通过观察毛冬青提取物对血管性痴呆小鼠学习记忆、海马区病理变化及凋亡相关蛋白表达的影响，探讨毛冬青改善血管性痴呆学习记忆的可能作用机制，为中医药防治VD提供实验依据。
1材料与方法
1.1动物KM种小鼠，雄性，SPF级，体质量32一35 g，由广东省实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(粤)2013-0002。实验动物喂养环境:温度23一25℃;相对湿度(50士5)%，常规饲料饲养。
1.2药物及主要试剂 毛冬青饮片分别购于康美药业股份有限公司和广州大翔药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波教授鉴定为毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青饮片300g，粉碎成粗粉，加入60%乙醇加热回流提取2次，依次用6倍量和4倍量溶媒分别提取1.5 h和1 h,滤过后合并药液，减压浓缩至150 m L，即得PHRE储备液，用时以蒸馏水稀释至所需浓度。
尼莫地平片，拜耳医药保健有限公司，批号:BJ24208; SABC免疫组化染色试剂盒，博士德生物，批号:11C29C。p-actin抗体，b iow orld，批号:AP0060。 Bcl-2抗体，abeam，批号:ab182858。B ax抗体，abeam，批号:ab32503。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔工所lg（H十L），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号:III-0011;
1.3仪器
A U M 220D电子分析天平，日本S h in ad zu公司;超低温冰箱，美国Thermo公司;制冰机，日本Sanyo公司产品;高速冷冻离心机，中国中科中佳科技仪器有限公司;多功能酶标仪，美国P erk iti E lm er公司;CM 1950冰冻切片机， A SP200S脱水机，E G 1160包埋机，RM 2135切片机，ST5020染色机，D C 300光学显微镜，均为德国Leica公司;小鼠条件恐惧试箱、X R -XC404条件性恐惧分析系统，上海欣软科技有限公司。
1.4分组、模型制备及给药
取雄性KM种小鼠，采用颈总动脉结扎反复缺血再灌注的方法制备经典VD模型:小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL}kgl)全身麻醉，分离双侧颈总动脉，用动脉夹阻断其血流30 min，松开动脉夹恢复血流10 m in，重复3次。于第1次阻断血流5min后，小鼠断尾放血约0.3 m L，冷凝止血。第3次血流再灌注后30 min，观察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可缝合皮肤。假手术组小鼠仅暴露双侧颈总动脉同等时间即可缝合皮肤。造模后第2天，除假手术组外，将模型小鼠随机分为5组，分别为模型组，尼莫地平对照组(30 mg/kg), PHRE低、中、高剂量组(含生药量5, 10, 20 g/kg }，每组12只。各组小鼠按l0mL/kg灌胃给药，连续35 d，每天1次，假手术组及模型组灌胃等体积的蒸馏水。
1.5行为学检测
1.5.1爬杆实验 第30天给药后2h，进行爬杆实验测试。将一根长50 cm、粗1.5 cm的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用纱布包裹以防打滑，小鼠头朝下放置于竹竿顶部，记录小鼠爬完杆长全长所需时间。正式记录评分之前，训练小鼠爬杆3d，每日1次，确保每只小鼠学会爬杆。根据爬杆时间进行评分，若小鼠坠落评7分，不动评6分，40 s掉头评5分，20 s掉头评4分，爬完全长31一40 s者评3分，21一30 s者评2分，11一20 s者评1分，0一11 s者评0分。
1.5.2条件恐惧实验
给药34 d后进行条件恐惧实验，实验分为两个阶段，第一阶段为恐惧训练阶段，即第34天给药2h后，将小鼠放入恐惧箱中，从20 s开始给予声刺激(75 dB , 2000 H )，持续10 s，从25 s开始给予光刺激，持续5s，从28 s开始足部电刺激((0.8 m A) 2 s。共进行4个循环，间隔时间各为15 s。第二阶段为测试阶段，即第35天给药2h后，将小鼠放入恐惧箱中，场景与受训阶段场景一致，提供相同的声、光等提示性信号，但不给予电击，动物仍将会表现出恐惧反应，通过观察动物的僵直时间来反映动物对恐惧的记忆能力。
