新一代超高通量基因组测序系统 GS FLX开创科研无限新...
新一代超高通量基因组测序系统 GS FLX开创科研无限新可能
GS FLX系统是由罗氏454生命科学公司推出的目前应用最广的超高通量基因组测序系统，研究人员利用高准确性、长读长的GS FLX系统快速的获得高质量的生物数据，取得科研突破性进展。自GS系统问世以来，于世界顶级杂志共发表250余篇高质量的文献，使GS FLX系统成为发表论文速度最快的高通量测序仪器。
应用原理
GS FLX测序系统依靠生物发光进行DNA序列分析，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度来达到实时测定DNA序列的目的（www.454.com）。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高度自动化等特点。每次测序反应只需10小时即可完成5亿个碱基数据，平均测序读长可达400到500个碱基，读长超过400bp时，测序准确性大于99.99％。
利用GS FLX系统的高度灵活性可以在众多领域进行开创性科学研究，进而为生物科学、医学研究开拓更多新的研究方向。
未知基因组测序
对于未知基因组如野生菌群，由于没有reference可以比对，其它测序仪（平均读长35bp）很难准确测得其序列，而GS FLX系统由于具备了一个反应500Mb的通量和长达450bp的单一读长能力，使其可以轻易的在一个反应里完成从细菌到病毒的未知基因组的全基因鸟枪法测序。标准的未知基因组拼接使用GS FLX de novo Assembler 软件把读长序列拼接成contigs。通过应用配对末端（Paired End）技术，可以对测序产生的contigs进行排序并决定它们的相对位置,从而获得高质量、完整的拼装。GS FLX是目前得到Gap最少、后续Finishing费用最低的测序系统。
细菌基因组中有很多重复序列，用Paired End 测序技术可跳过3Kb重复序列。明年初454公司将推出20Kb Paired End 测序技术，这样所有基因组中的最长的重复序列都能跳过，细菌基因组拼接可一次完成。
基因组重测序
微生物基因组：GS FLX最早应用于细菌的全基因组测序，其特点是测序速度非常快。Johnson & Johnson药物研发中心曾利用454测序技术检测样本中被药物抑制的基因。通过增加药物剂量筛选抗药菌株，能够存活下来的菌株因突变而带有抗药性，突变位点即可能是药物靶点。由于细菌突变位点通常比较多，所以选取两个抗药菌进行测序，并跟原始的非抗药菌做比对。测得的几千万个碱基数据显示，抗药菌的四个位点有突变，没有带抗药性的菌株无突变。进一步研究发现其中一个酶是药物靶点。此实验使用GS FLX仅一个星期即可测完一个细菌，得到实验结果。
大型动物、植物全基因组：454公司曾与澳大利亚、新西兰实验室合作，用测序方法筛选羊基因组的genetic marker，测序覆盖率0.5倍，共测得1.5G数据。然后用牛的基因组草图进行拼接比对，即可获得genetic polymorphism。应用此方法可迅速的筛选几千万个marker。此外，结合Sanger和454，已经测出葡萄的序列。桔子、高梁、玉米等植物也在使用454进行基因组测序。
人体基因组结构和突变：使用长读长和Paired End技术来探测大规模的基因组变动，能获得更大的基因组覆盖率，鉴定更多的基因变异，如基因片断的插入、缺失或拷贝数变异，相比短读长技术可多获得25％以上的信息。454公司跟耶鲁大学某实验室合作，用人的基因组做Paired End 文库，将文库大小调整至约3Kb，并对两端进行测序。发现所得数据与基因组数据相差6Kb，以此可推测样品有3Kb的片断缺失。
扩增子测序
GX FLX的扩增子测序灵敏度高，可鉴定低频率突变和单倍体，如外显子或病毒准种，可检测到低于0.5％的变异。例如基于扩增子超精细（ultra-deep）测序方法，可在混合的肿瘤样品中识别稀少的体细胞突变，或者在微生物、人类、动物或者植物群体中分析遗传差异，揭示SNP位点。
GS凭借能够以前所未有的敏感性和速度从混合样本中快速准确的鉴定突变，被应用在HIV抗药性变化的研究中。由于HIV反转录酶的误差量很高，HIV在人体内突变速度非常快，而且会使药物靶点也发生突变，从而使药物失效。某制药公司用GS FLX对病人血液中的HIV进行测序，通过将测序结果与Stanford 大学建立的突变与药物失效关联性的数据库进行比较，判别HIV是否出现抗药性，如果出现则立即换药。
环境基因组学
较之短读长技术，GS FLX可更精准的预测物种在不同环境下的差异性。如麻省理工某海洋生物研究所采集火山口附近的生物样品，对海底生物进行研究。通过对细菌样本测序，发现海底生存的细菌与陆地细菌菌种不同，不同海域的细菌也有完全不同的细菌组成，而且几年后的演化也有不同。
新传染病源快速鉴定
GS FLX为快速鉴定新的疾病病源提供了高效精准的检测工具。2008年三位澳大利亚病人接受了肝脏移植手术，捐献者为五十七岁男子，死于脑溢血。但是手术四至五周后，三名受捐者因患类似疾病而陆续死亡。哥伦比亚大学研究人员预计有未知病毒在肝脏移植时没能通过常规方法检测到，于是使用GS FLX对所有cDNA进行测序。测得的十万余序列结果显示，其中十四个序列确实与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒相似，通过PCR方法也验证了此病毒亦出现在受捐者器官内。
受此研究启发，肿瘤研究人员利用454测序验证病毒与肿瘤的发作是否有直接作用关系。通过检测皮肤瘤cDNA，发现多处肿瘤的T antigen与人体 receptor tyrosine phosphatase
形成融合蛋白。于是研究人员设想病毒可能通过此结合方式抑制相关蛋白，进而可能导致肿瘤的发育。通过检测更多不同的肿瘤细胞，发现不同的肿瘤细胞均有同样的融合蛋白，从而验证了病毒会导致肿瘤的发育，病毒产生抗药性机制跟肿瘤相似，均是通过突变的方法。
基因甲基化
启动子区域CpG岛的低甲基化和高度甲基化是许多基因进行活性调节的重要机制之一。通过亚硫酸盐处理，GS FLX可以对指定的目的基因组序列内每个CpG岛甲基化状态进行检测，并对每一个甲基化进行定量分析。如对结直肠癌的样本和它们临近的正常组织进行分析，用亚硫酸盐对样本启动子进行处理，如无C到T的转化意味该位点没有甲基化，反之则该位点发生了甲基化。每个肿瘤可绘一图谱，通过图谱间的比较，可发现有些基因在不同的肿瘤有不同的profile，进而启发新的科研预测。
基因表达
较之短读长技术，长读长技术可发现更多的基因注释，更准确的预测假基因，并获得可靠的等位特异表达谱，可以更灵敏的检测基因表达的高低，更好的拼接基因模型。有些Sanger很难测到的表达量非常低的基因序列，454都可检测到。
突破测序样品准备瓶颈
随着高通量测序技术的不断发展，使用常规PCR方法进行大量重测序样品准备费用高、耗时长。针对此问题，罗氏NimbleGen(www.nimblegen.com)成功开发了目标序列捕获芯片（Sequence Capture Array）技术，可在一张芯片上富集长达 5Mb的任意目标基因组区域，如外显子、疾病相关区域、启动子、增强子等。相对PCR方法，此技术可大大降低样品准备的时间及费用。今年底，NimbleGen将推出2.1M芯片，可同时富集30Mb的目标序列。NimbleGen序列捕获技术与GS FLX高通量测序仪的完美结合致力于以最低的价格、最好的性能实现特定应用领域的研究，带给生物医学研究飞跃性突破。
