反相高效液相色谱
实验材料 蛋白质标样
试剂、试剂盒 乙睛（HPLC级）去离子水（HPLC级） 三氟乙酸（TFA)
仪器、耗材 HPLC 色谱系统 反相柱
实验步骤
1.进行空白或对照层析谱分析（即在步骤①中不加样）。一般这是进行一天层析工作的开始。下面是推荐使用的用于 RP-HPLC 系统评估的标准色谱条件。
（1）线性梯度：从 0~100% 的溶剂 B，溶剂 A 是 0.1% 的 TFA 水溶液 (体积分数），溶剂 B 是含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液；
（2）梯度率：1%B/min(即 60 min 内溶剂 B 从 O 到 100%);
（3）流速：lml/min(4.6 mm 内径层析柱）；0.lml/min(2.1 mm 内径层析柱）
（4）温度：40~45°C。
2.标样蛋白（对照组）色谱分析。在步骤①中，对于 4.6 mm 层析柱来说，注入 1OOul 标样蛋白（0.lmg/ml)(即每标样蛋白为 10ug，流速为 lml/min 时 1ug=1OOmAU); 对于 2.1 mm 层析柱，加入 l0W 浓度为 0.lmg/ml 的标样蛋白，即每种标样蛋白 1ug(在流速为 0.lml/min 时，1ug=100mAU)。
3.消化肽的混合物色谱分析，用与步骤②中相同的条件。
4.样品的收集。在有盖的聚丙烯微量离心管中收集洗脱下来的肽峰，盖紧盖子，于-20°C 保存，以便进一步研究。如果是人工收集样品，检测器的流动池与出口管间的死体积必须精确计算。
5.对于要长期保存的层析柱，先将层析柱冲洗干净，然后储存于亲水性有机溶剂中（如 50% 丙酮水溶液）。对于过夜保存的层析柱，可以用溶剂 B 以非常低的流速冲洗层析柱（如流速为 50ul/min)。
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