RT-PCR检测汉坦病毒基因及分型
材料：
（1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒
（2）引物：
引物 | 序列（5’～3’） | 位置 | 片段（bp） |
逆转录引物 | TAGTAGTAGACTCC | 1~14 | LMS |
通用外引物 | AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG | 1910~1939 | M(+) |
GTACAICCTGTRCCIACCCC | 2373~2354 | M(-) | |
型特异性引物 | |||
汉滩病毒 | GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC | 1958~1984 | M(+) |
GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC | 2318~2340 | M(－) | |
汉城病毒 | GTGGACTCTTCTTCTCATTATT | 1936~1957 | M(+) |
TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG | 2331~2353 | M(－) | |
S片段引物 | ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG | 1200~1220 | S(+) |
GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA | 1670~1696 | S(-) |
方法：
1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按说明提取，制备模板RNA；
（2）逆转录、合成cDNA：采用 SuperScripTMII或AMV逆转录酶，按说明书进行；
（3）PCR扩增：反应条件为95℃预变性10分钟，94℃60秒、55℃60 秒、72℃45秒、扩增30～35个循环，72℃延伸12分钟。
（4）扩增产物用1～2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明为特异性扩增产物。
必要时，可进行：
（5）PCR片段的回收和核苷酸序列测定：切下特异分子量条带，用QIAquick凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序。
意义：扩增到特异性条带可确诊汉坦病毒并明确其型别，序列测定还可以对汉坦病毒的变异情况进行研究。
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