iRNA干扰GFP表达实验
【原理】
RNA沉默是发生在植物（转录后基因沉默或共抑制）、动物（RNA干扰，RNAi）和真菌（消除作用）等真核生物细胞中的的特异性和高效率的mRNA降解机制。在哺乳动物细胞中，RNAi通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(smallinterferingRNAs)，或者是45—50-mer的发夹结构RNA（smallhairpinRNA,shRNA）转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。选用PolIII启动子启动编码shRNA(smallhairpinRNA)的序列。PolIII启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有PolIII启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。
【试剂与仪器】
1．小牛血清。
2．双抗溶液（链霉素100μg+青霉素100单位）。
3．DMEM培养基。
4．转染试剂（LIPOFECTAMINE2000）。
5．细胞培养基（DMEM+10%NCS）。
6．PBS。
7．无血清培养基。
8．胰酶（Trypsin）。
9．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml离心管，微量移液器，荧光显微镜，连续光谱荧光酶标仪。
【操作步骤】
1.寡核苷酸单链的设计及合成
采用Ambion公司的siRNATargetFinder（onlinetargetfinder）进行siRNA的设计（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html），公司合成。
siRNATargetSequenceONE:5'-AAGGTGATGCTACATACGGAA-3'
SensesiRNAstrand:5'-GGUGAUGCUACAUACGGAAtt-3'
AntisensesiRNAstrand:3'-UUCCGUAUGUAGCAUCACCtt-5'
Positioningenesequence(cDNA):104
TopStrandOligonucleotideTemplate:(59mer)
5'-CGGTGATGCTACATACGGAATTCAAGAGATTCCGTATGTAGCATCACCTTTTTTGGTAC-3'
BottomStrandOligonucleotideTemplate:(59mer)
5'-CAAAAAAGGTGATGCTACATACGGAATCTCTTGAATTCCGTATGTAGCATCACCGGGCC-3'
2．shDNA的退火
用无核酶水稀释合成的单链寡核苷酸至200μmol/L
反应体系组成：
TopstrandDNAoligo(R)（200μmol/L）5μl
BottomstrandDNAoligo(F)(200μmol/L)5μl
10×OligoAnnealingBuffer2μl
DNase/RNasefreewater8μl
Totalvolume20μl
程序退火
95℃4min变性
90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃、20℃、10℃每10度递减，依次反应3min
4℃10min
-20℃保存
取1μl产物2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定退火程度。
3．U6-shDNA质粒构建
用ApaI和KpnI双酶切含人源U6启动子的质粒，回收线性质粒（参见实验一步骤9）。
用连接酶将步骤2退火片段与线性的载体连接。
在0.2ml或0.5ml反应管中加入下列成分
线性载体 50ng
shDNA100ng
T4连接酶2-3weissunits
10×连接缓冲液1μl
补超纯水至总体积为10μl，常温下放置30分钟以上；也可以16℃或4℃过夜。
4．转化细菌筛选阳性重组子（参见实验四）。
5．扩增含阳性重组子的细菌，提取质粒，备用。
6．转染细胞（参见实验五）。
7．荧光显微镜观察GFP的表达变化，用荧光酶标仪测荧光强度的变化。
