天然产物中多糖的分离、纯化与鉴定(2)
二、粗多糖的纯化
粗多糖溶液加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝3：1混合摇匀)后，置恒温振荡器中震荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心(3000r／min)分离，去除蛋白质。然后浓缩，透析，加入4倍体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干。
取样品0.1g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2的平衡缓冲液中。上样，用Buffer A: 0.1mol
NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl
PH=7.2 进行线性洗脱，分部收集。各管用硫酸苯酚法检测多糖。合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，即得多糖级分。
第二部分多糖的鉴定
目的要求
（1）了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。
（2）了解红外光谱法鉴定多糖的原理和方法。
实验原理
采用薄层层析法分析单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和Rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和Rf值，确定样品多糖的单糖组分。
多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱 (IR)和紫外光谱(UV)等技术，气相(液相)色谱—质谱(GC／HPLC—MS)联用技术成为分析多糖更为有效的手段。
本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类物质。0—H的吸收峰在3650—3590cm－1，C—H的I申缩振动的吸收峰在2962—2853cm－1，C＝O的振动峰为1510
—1670－1之间的吸收峰，C—H的弯曲振动吸收峰为1485—1445cm－1，毗喃环结构的C—0的吸收峰为1090cm－1。
试剂和器材
一、试剂
浓硫酸，氢氧化钡。
展开剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶＝7：20：12：7：6：6。
显色剂:1，3－二羟基萘硫酸溶液（0.2％1，3－二羟基萘乙醇溶液）：浓硫酸＝1：0.04（V/V）。
单糖标准品。
二、器材
沸水浴, 玻璃板，傅里叶变换红外光谱。
操作方法
一、单糖组分分析
1．薄层板制备：称取硅胶5g于50ml烧杯中，加入用 12 mL 0.3mol／L 磷酸二氢钠水溶，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上(7．5cm×10cm)，110℃活化1h。即置有干燥剂的干燥箱中备用。
2．点样：称取少许的多糖(0．1克)于2．0mL离心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水浴水解2h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2—4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。
3．展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10—15cm），取出薄层板，晾干。
4．显色：将展开凉干后的薄板再在100℃烘箱内烘烤30分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在110℃下烘烤10分钟即可显色。
薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及Rf值，确定样品中有哪几种糖。
二、红外光谱在多糖分析上的应用
将冻干后的样品用KBr压片，在4000～400cm-1区间内进行红外光谱扫描，有如下的多糖特征吸收峰：3401 cm-1（O-H），2919
cm-1(C-H), 1381 cm-1及1076 cm-1（C-O）。在900
cm-1处的吸收峰说明该多糖以β-糖苷键连接。在N－H变角振动区1650-1550cm-1处有明显的蛋白质吸收峰，表明该样品是多糖蛋白质复合物。
