蛋白质印迹法有什么缺点？
蛋白质印迹是生化实验室中最常见的程序之一。基本上,它从大小上将蛋白质与样品分开,然后使用抗体进行测试以确定是否存在给定的蛋白质。它不仅在研究中有用,而且在医学或诊断实验室中也有用。例如,针对HIV和莱姆病的检测均包括酶联免疫吸附测定(ELISA)检测,如果ELISA检测呈阳性,则进行蛋白质印迹分析。然而,尽管它很流行,但是蛋白质印迹具有一些缺点。
非量化
古典蛋白质印迹是非定量的。换句话说,尽管他们可以告诉研究人员是否存在某种特定的蛋白质,但他们无法量化存在多少蛋白质。一些生物技术公司现在出售试剂盒,使研究人员或实验室技术人员能够使用标准曲线定量蛋白质的含量-但这仅在有相同蛋白质的纯样品可用时才有效。此外,蛋白质的分子量只能通过蛋白质印迹法估算,而不能像质谱法那样精确确定。
抗体
仅当可获得针对目的蛋白的一抗时,才能进行蛋白质印迹。生物技术公司可以提供许多不同蛋白质的抗体,但它们并不便宜;如果无法使用给定蛋白质的一抗,则无法进行蛋白质印迹以寻找特定蛋白质。此外,研究人员可能想确定某种蛋白质是否已被修饰(例如,是否已被磷酸化(例如,其上有一个磷酸基团连接)),并且通过蛋白质印迹技术,他们需要对该修饰蛋白具有特异性的抗体蛋白。
训练
正确进行蛋白质印迹并获得良好的结果可能具有挑战性,因此必须对员工进行良好的培训。在这方面,经验也许是最好的导师。即使对于有经验的技术人员,蛋白质印迹也是费时的。例如,实验的凝胶电泳仪部分通常需要一到两个小时才能运行。当然,在凝胶运行时还可以执行其他任务,但是实验仍然需要相当长的时间才能获得结果。
其他限制
抗体有时可能会表现出脱靶结合,这可能导致较差的结果。此外,通过蛋白质印迹,您将使用针对特定蛋白质的抗体,因此您的结果只会告诉您该蛋白质是否存在。相比之下,高分辨率质谱分析揭示了样品中存在的所有蛋白质,与经典的蛋白质印迹不同,它是定量的。当然,重要的是要记住,与蛋白质印迹法相比,质谱法昂贵得多,并且使用起来在技术上也更具挑战性。
