蛋白质印迹法的结果分析
可能出现的问题如下。
1．背景过高
①封闭不充分，应更换封闭液或延长封闭时间；
②抗体浓度过高，应适当增加抗体稀释倍数；
③洗膜不充分，应增加洗涤次数或洗涤时间；
④膜质量较差，应选择高质量的NC膜，并且整个实验过程中保持膜的湿润。
可能原因 | 验证或解决办法 |
|---|---|
膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸膜5~10min |
洗膜不充分 | 增加洗液体积和洗涤次数 |
阻断不充分 | 增加封闭液孵育时间，或者提高温度选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉、酪蛋白等） |
二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 |
检测过程中膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 |
曝光过度 | 缩短曝光时间 |
抗体与阻断蛋白有交叉反应 | 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 |
2．没有阳性条带或条带很弱
①目的蛋白质未充分转移到膜上或洗膜过度，应使用丽春红S染色以检查转膜效果，或减少洗膜次数，缩短洗膜时间；
②抗体不匹配或一抗过期或一抗不能识别变性或还原的蛋白质，应注意选择特异性的抗体并在有效期内使用，或改用非变性凝胶系统；
③抗体浓度低，应适当增加抗体浓度，或延长孵育时间；
④样品中的目的蛋白质含量低或没有目的蛋白质，应增加上样量；
⑤封闭过度，应更换封闭液，缩短封闭时间。
可能原因 | 验证或解决办法 |
|---|---|
抗体结合不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 |
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因 |
试剂不匹配 | 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 |
一抗失效 | 选择在有效期内的抗体；并选择现配现用的工作液 |
HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 |
膜没有完全均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
靶蛋白分子质量小于10kD | 选择小孔径的膜，缩短转移时间 |
转移时间不够 | 对于厚的胶以及高分子量蛋白质需要延长转移时间 |
抗体活性降低 | 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 |
封闭过度 | 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 |
曝光时间过短 | 延长曝光时间 |
3．非特异性条带多或位置不准确
①目的蛋白质被乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化，应选择去修饰剂以恢复原有目的蛋白质大小；
②目的蛋白质降解，制备样品时应使用蛋白酶抑制剂，并使用新鲜标本；
③抗体浓度过高，应适当稀释抗体；
④目的蛋白质存在二聚体或多聚体，样品应充分煮沸10min，使蛋白质彻底变性再上样。
可能原因 | 验证或解决办法 |
|---|---|
二抗的非特异性结合 | 增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） |
一抗的特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 |
蛋白质降解 | 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 |
二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 |
抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 |
蛋白质上样量过大 | 降低上样量 |
封闭剂中有聚集体 | 使用前过滤封闭试剂 |
HRP耦联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，去除聚集体 |
HRP含量过高 | 降低酶联二抗的浓度 |
问题 | 原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
胶不平 | 玻璃板不干净 | 胶板洗刷干净； |
催化剂或加速剂的量不合适 | 加入过硫酸铵和TEMED的量要合适； | |
试剂未混均，致使部分胶块聚合不均匀 | 加入试剂后摇匀，使其充分混合； | |
受热不均匀导致胶聚合不均匀 | 温度合适 | |
凝胶漏液 | 玻璃板未对齐 | 两块玻璃板底部要对齐 |
条带比正常的窄 | 凝胶聚合不均匀 | 灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓； |
加样孔扭曲 | 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 | |
“微笑”条带 | 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一 | 纯化样品，调整盐浓度 |
“倒微笑”条带 | 胶板底部有气泡会影响电泳效果 | 应赶走胶板底部气泡，同时注意电泳槽装置是否合适 |
凝胶肿胀或卷曲 | 取出凝胶后暴露空气中过久 | 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5~10min |
条带歪斜或漂移 | 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致 | 可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 |
单个或多个白点 | 膜与胶块之间有气泡 | 确保膜和胶块之间没有气泡 |
转膜缓冲液过热 | 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高 | 转膜过程注意降温 |
背景过高 | 膜没有均匀浸湿 | 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 |
膜或者缓冲液污染 | 拿取膜与吸水纸时要戴手套 | |
封闭不充分 | 更换新鲜转膜缓冲液 | |
抗体与封闭剂出现交叉反应 | 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 | |
抗体浓度过高 | 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 | |
封闭时间与清洗时间过长 | 减少封闭或清洗时间 | |
上样量过大 | 合适的上样量 | |
压片时间过长 | 缩短压片时间 |
