人晶状体上皮细胞在体外基质中的生长与分化
实验概要
本文描述了体外生长的人晶状体上皮细胞的生长情况与非永生化人晶状体上皮细胞的成熟过程。
从18周大的胎儿晶状体上获得的人晶状体上皮细胞，在培养基中维持在牛角膜内皮(BCE)的细胞外基质(ECM)上，辅以纤维母细胞生长因子(FGF-2)。从培养过程中的特点、生长以及分化以染色体组型、细胞形态、和生长动力学研究、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、抗体荧光染色以及免疫印迹分析这几方面为特征来阐述。
实验步骤
1. 细胞培养
来自18周大胎儿的晶状体上皮细胞进行原代培养。提供晶状体捐献者要没有眼睛异常的病史。材料的获得已获政府批准。将传代至2-3代的冷冻人晶状体上皮细胞样品，在牛角膜内皮(BCE)的细胞外基质(ECM)上培养，扩增人晶状体上皮细胞的冷冻样品，这个将在之后叙述。本研究使用已经繁殖到第十代的细胞，在次代培养速度开始下降以及细胞特征改变之前进行的。
由Usha P. Andley提供的永生的人晶状体上皮B-3细胞在本试验中进行对照。这些细胞通过感染腺病毒12猴病毒(ＳＶ)40得到转化，并且已经被传代到76数量倍增指数。我们使用来自第13-18代的细胞进行本研究。
新鲜的牛眼睛从当地的屠宰场获得。获得动物组织的方法符合相关法律。
2. 牛角膜内皮(BCE)细胞基质的准备
牛角膜内皮(BCE)的原代培养使用Gospodarowicz and Ill创立但经过Song and Lui修改的方法。我们在制定试验计划的时候又做了一些其他的修改。原代角膜上皮移植体从牛眼睛上分离出来，细胞在37°C、10% CO2、生长基质(DME-H16、低糖)、15%胎牛血清、5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、300µg/ml谷氨酰胺、50µg/ml庆大霉素以及2.5µg/ml两性霉素B中进行培养。成纤维细胞生长因子(FGF-2)从牛垂体源纯化获得。为了最小化对原代培养的干扰，成纤维细胞生长因子(FGF-2)(在0.005%牛血清白蛋白中)在第2和第4天被加入到培养皿现有的基质中。在第6和第8天的时候，除去已经失效的基质并且轻柔的换上新鲜的培养基质。在第10天，牛角膜内皮(BCE)原代培养以1:5比例传第一代(P1)。培养皿用不含有Ca2 和Mg2 的PBS冲洗两次，用2mlSTV(0.5%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA)冲洗两次，少于30秒，并且用500µlSTV胰酶消化1分钟，然后快速地用4.5ml生长基质中和STV，细胞悬浮液要轻柔的混合，加入1ml至每个含9ml生长基质的100mm塑料培养皿中。P1培养用和原代培养一样的方法进行。在第10天时，P1培养在细胞外基质(ECM)培养基(生长介质含4%的葡萄聚糖)上进行继代培养，生长出ECM。3个100-mm培养皿中的细胞被移植到500mlECM基质中。100mm、60mm和35ml 培养皿分别接受10ml、4ml和2ml的接种体。细胞外基质(ECM)上细胞培养的生长和养料的提供与之前的培养一样。在细胞外基质(ECM)培养与染色的样本完全融合到没有可见的裂口时(这个变化发生在第7到第10天)，收获之前要培养保持融合整整3天(第10到13天)。为了收获细胞外基质(ECM)，室温下细胞用0.02M氨水处理5分钟，之后用预冷的含有Ca2 和Mg2的PBS冲洗5次。用细胞外基质(ECM)覆盖的培养皿保存在4°C，含有2.5µg/ml两性霉素B和50µg/ml庆大霉素的PBS中，需要在6个月之内用完。基质在使用之前要洗去抗生素。
3. 生长与细胞培养条件
人晶状体上皮细胞在DME-H16中细胞外基质(ECM)上生长，含有15%FBS、50µg/ml庆大霉素、2.5µg/ml两性霉素B和5ng/ml的纤维母细胞生长因子(FGF-2)，培养温度为37°C，10%CO2中。人晶状体上皮细胞在用不含Ca2 和Mg2 的PBS冲洗后，37°C 下胰酶消化30秒。将细胞轻柔的混合并计数。培养基每隔一天就更换一次新鲜介质。增长曲线动力学显示细胞在继代培养24小时后，有50%的平板接种效率。细胞很紧密地结合到细胞外基质(ECM)上，其中80%的活细胞在15分钟后就附着了。细胞被快速地移植到培养皿上，并且均匀地涂布。一旦这些细胞融合，它们就开始生长。
人晶状体上皮细胞在37°C、10%CO2、含有20%FBS和抗生素，但是不含有纤维母细胞生长因子(FGF-2)的Sigma的基本培养基(MEM)中培养。人晶状体上皮B-3细胞在37°C、10%CO2、不含基质的组织培养板上培养，一周两次胰酶消化进行继代培养。
每个细胞系细胞的生长方法，细胞被稀释到1×104/ml，每2ml(在35mm培养皿中)或4ml(在60mm培养皿中)以3-4×104/ml的细胞密度被移植。在移植后一小时内最初的时间点上，以及之后的时间间隔，最多两个相同的培养皿进行胰酶消化，并且细胞数用粒子计数器计算。扫描电镜对细胞进行计数，描绘3~5个独立试验的生长曲线数据显示培养中时间功能函数。
4. 人表型的染色体分析和原位杂交
以指数方式生长的人晶状体上皮细胞在传到第六代时，用0.05µg/ml秋水仙碱处理1h使细胞分裂停止在中期。然后收获细胞并在37°C下保存在M KCl中20分钟。细胞用3:1的甲醇和醋酸缓慢固定，之后放在磨光玻璃载玻片上。细胞用0.25µg/mlDAPI染色并用相反的DAPI的G带进行分析。对第10期中期延伸的染色体分析通过斯凯维尤软件(Skyview software)进行。染色体与红色标记的人胎盘Cot-1 DNA23光谱来确定细胞是来自人体的。
5. 透镜状结构计数
透镜体的数量用200×10倍的显微镜进行计数，对于指数形式增长和融合的人晶状体上皮细胞的培养在100mm直径培养皿中进行培养。视野中出现类似于球形的和高折射率多细胞团簇(直径大概为20 m)就被认为是透镜状结构，这点和其他人描述的都差不多。透镜状结构生长在平铺的人晶状体上皮细胞周围，很难聚焦拍照。透镜状结构的SEM数量就可以算出来。
6. 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
使用AGPC法将总RNA从人体晶状体上皮细胞上分离出来，RNA的质量和产量通过测量260和280 nm吸光度值得出。总RNA提取依据试剂盒的说明进行，通过反转录试剂盒反转录为单链cDNA。总RNA中的1~5µg用oligo(dT)培养，反应条件为70°C 10分钟，立即冷却为4°C。将含有1 ×第一链缓冲，0.01M的DTT，以及0.5mM 2’-脱氧核苷三磷酸(dNTP)的反应混合物加入其中，42°C培养1小时。酶的作用在加热到70°C时15分钟，退火。为了进行对照，在同一实验组中的所有样品都进行等量的RNA反转录。
PCR条件和引物
αA-晶状体蛋白的引物：上游引物5‘-ATGATGGACGTGACCATCCAG-3’；下游引5‘-GGCTGCTATCTAA-3’。预计的产物大小是754bp。βB2-晶状体蛋白的引物：上游引物5‘-GCAAGGGCGAGCAGTTT-3’；下游引物5‘-GTTGGAGGGGTGGAAGG-3’。预计的产物大小是434bp。GAPDH的引物：上游序列5‘-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’；下游序列5‘-CATGTGGGCCATGCAGGTCCACCAC-3’。预计产物大小Wie983bp。FGFR1的引物：上游序列5‘-CGAGCTCACTGTGGAGTATCCATG-3’; 下游序5’-GTTACCCGCCAAGCACGTATAC-3’。除非特殊情况，在标准的25µl反应物中使用MgCl2(1.5mM)。对于βB2-晶状体蛋白，PCR条件为94°C，2分钟； 94°C，30秒；55°C，30秒；35个循环，然后在72°C，1分钟，之后72°C，5分钟进行最后的伸展。对于αA-晶状体蛋白，PCR条件为95°C，2分钟； 95°C，1分钟；35个循环，60°C，1分钟。Mg2 浓度在最后反应物中补充到2mM。对于FGFR1，PCR条件与αA-晶状体蛋白一样，除了在最后反应物中补充Mg2 。GAPDH条件为， 94°C，5分钟进行最初的变性，然后在60 °C下退火45秒，进行35个循环，72°C，1分30秒进行扩增，94°C，45秒，以及72°C，10分钟进行最后的扩增。
7. 免疫组织化学
对于免疫组织化学实验，在细胞外基质(ECM)上培养的单细胞层用4%的多聚甲醛固定。用来荧光染色的是在PBS中添加5µg/ml TRITC，可看到丝状肌动蛋白；1µg/ml的DiOC6(分子探针)，其可以给所有细胞和细胞器膜染色，并且0.25µg/ml的DAPI可以用来检测核质。加入一抗和二抗。所有的试验至少重复一次，而且对于每个一抗和二抗的控制都要进行监视以避免非特异性免疫的出现。
8. 免疫印迹分析
从培养的细胞中提取总蛋白，将细胞在冰上用提取缓冲液进行处理，缓冲液包括2%SDS、100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(PH6.8)、30%的甘油、蛋白酶抑制剂Boehringer–Mannheim, Mannheim, Germany、5mM苯甲基磺酰氟 [PMSF]，以及1:2000的抑肽酶。细胞裂解液集中起来并立即冷却到-80°c。上清液蛋白质的浓度使用试剂盒(Lowry DC Assay Kit; Bio-Rad, Hercules, CA)可以进行测量。对于SDS-PAGE，30µg的总蛋白质转移到1.0mm的厚胶中。根据分子量小于40kDa来分离蛋白质，7.5%的蛋白质拥有大于40kDa的分子量。胶被移到(Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA)上，在转移缓冲液(20%的甲醇、0.1%SDS、20mM Tris [pH 8.3]以及150mM甘氨酸)20V和4°C的条件下过夜(大概16个小时)。对于免疫印迹，封闭膜之前在0.5%TBS(100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 8.0)、150mM的NaCl和0.5%Tween-20)中清洗。一抗和二抗在相应的封闭试剂中进行稀释，然后分别进行2小时和半小时室温下培养。所有的二抗都要与辣根过氧化物酶(HRP)结合。蛋白质要用ECL进行分类检测。条带的数量使用图像分析仪完整的检测出来。分子量标记物包括如下：人重组FGF-2，SK-Hep1全细胞裂解液、RPN 756(Amersham)，牛晶状体提取物，以及α-和β-纯化晶状体蛋白标准。
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