PCR技术的原理与方法（3）
PCR常见问题
一.没有扩增产物
1.循环温度：变性温度、退火温度
2.引物设计
3.DNA聚合酶活性
4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份)
5、DNA样品
二.非特异产物及电泳呈涂布状
1.Mg2 浓度
2.调整引物、模板、聚合酶的用量
3.适当减少循环数
4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间
•三.引物二聚体的形成
1.检查引物的序列
2.提高退火温度
3.调整引物与模板浓度
4.增加引物长度
• 四.假阳性结果的预防
1、实验器材应一次性使用(吸咀、PCR管)
2、注意操作环境，戴一次性手套
3、严格PCR操作规程
4、多次取样的试剂应分装
5、设置阴性对照和阳性对照
PCR相关技术
一.锚定PCR(anchored PCR)：
•引进锚定引物，可以帮助克服序列未知或序列未全知的障碍。
•在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，与此相对应的锚定引物poly(dC)一般应在十二聚以上。
二.不对称PCR(asymmetric PCR)
不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序。
三.反向PCR(inverse PCR)
四.多重PCR(multiplex PCR)
多重PCR是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。
多重PCR技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性，而是在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性。
应用于基因诊断，对与疾病相关的基因（庞大）进行扩增检测。
五.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)
•由mRNA逆转录产生cDNA链作为PCR反应模板。
•逆转录合成cDNA时，引物可选用特异引物、随机六聚体引物或寡聚dT(12-18)。
•设计RT-PCR的引物时最好是分散在不同的外显子上，以免基因组DNA的污染导致假阳性结果
六.差别PCR(differential PCR)
差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中，用同一套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。
七.原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。
基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测
优点：灵敏度高，可进行细胞内定位
八.荧光定量PCR(FQ-PCR)
荧光定量PCR：融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团)，结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。
主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针，PCR过程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。
•荧光定量PCR的优点：
•1.可进行准确的定量检测。用于基因诊断。
•2.定量范围宽。
•3.特异性更强，克服了假阳性。
•4.操作简单快速，无须后处理和电泳检测。
•5.安全，技术易于学习，易于进行电脑化数据管理。
PCR技术的应用
1.遗传性疾病的基因诊断
2.传染病的诊断(肝炎病毒)
3.癌基因检测
4.法医学(亲子鉴定)上的应用
5.DNA测序
6.基因克隆
7.引入基因点突变,基因融合等
