DNA降解断裂法检测肿瘤细胞凋亡
| 实验方法原理 | 凋亡的DNA降解选择性发生在核小体间DNA，提取细胞总DNA或者选择性提取小分子量DNA后电泳可检查独特的核小体间片段DNA。 |
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| 实验材料 | 肿瘤细胞 |
| 试剂、试剂盒 | PBS 裂解缓冲液 苯酚 氯仿 异戊醇 乙醇 氯化钠 TE缓冲液 TAE TBE 琼脂糖凝胶电泳 磷酸-柠檬酸缓冲液 蛋白酶K R Nase酶 细胞消化液 EDTA |
| 仪器、耗材 | 离心机 紫外分光光度计 电泳仪 离心管 烧杯 玻璃棒 量筒 |
| 实验步骤 |
一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb。 二、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。 三、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。 四、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 五、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。 六、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。 七、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。
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| 注意事项 |
影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：①DNA分子大小，DNA分子越大迁移速度越慢。②迁移率与琼脂糖浓度成反比。③DNA构象：a.相同分子量的超螺旋环状（Ⅰ型），切口环状（Ⅱ型），线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶。b.一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④电压：迁移率与所加电压成正比，但是电压过大有效分离范围减小。⑤电场方向：单一方向速率均等，改变方向，极大分子DNA迁移更慢。通过脉冲电场凝胶电泳分离极大DNA。
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| 其他 |
通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小。如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好。若DNA分子量小或一片模糊，表明DNA有降解。
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