ES细胞打靶技术介绍
你听说过喀迈拉兽（chimera）吗？没错，就是古希腊神话故事中一只会喷火的怪兽，这种怪兽拥有狮头、羊身、蛇尾，像是由几种动物拼成的。
或许你知道喀迈拉兽，但你是否知道在生物遗传学中也有一种名为喀迈拉的动物吗？那这神奇的怪兽与我们生物领域中的ES细胞基因打靶到底有什么关系呢？本期话题，咱们就一起来聊聊遗传学中的chimera。
图1. 希腊神话中的喀迈拉兽（左）和现代生物遗传学中的 “Chimera”（右）
Chimera在生物学中是一种很常见的现象，一般可以理解为嵌合体，如怪兽是由不同动物组成，在生物中如上图的老鼠，就是ES细胞打靶技术得到的chimera小鼠。
之所以这里谈论ES细胞，是因为这项技术已经广泛应用于基因功能和基础理论的研究、疾病模型的建立、基因治疗和优质育种等。小编现在就带着大家一步步走入ES细胞这个神奇的世界，把此技术的原理及实验技巧等心得毫无保留地分享给大家。
ES细胞打靶的原理
胚胎干细胞( Embryonic Stem Cell, ESC )是在胚胎植入子宫前，从囊胚状态的胚胎的内细胞团（Inner cell mass, ICM）分离出来的一群多能干细胞，理论上可分化为任意的体细胞。
基因打靶技术即建立在ES细胞与DNA同源重组等技术基础上的分子生物学技术。利用同源重组技术对ES细胞特定位点的基因进行改造，通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得修饰的遗传信息经生殖系遗传。尤其是近几年CRISPR/Cas9掀起的基因编辑浪潮，极大地催化了ES细胞基因打靶技术的步伐，丰富了科研人员对人类疾病和相关基因功能的了解。（图2）
图2.CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑
ES细胞打靶的实验步骤：
ES细胞扩增至合适密度，消化并进行细胞计数。为提高电转效率，用1xDPBS重悬细胞沉淀；
细胞计数后取5x106细胞悬液至灭菌1.5ml EP管中，并加入sgRNA（10μg）和Cas9（10μg）表达质粒、Donor质粒（15μg），混合均匀，并将体积用1XDPBS补至800μl，后将液体转移至洁净电转杯（Bio-Rad, 4mm）中；
电转仪进行电转，电转后向电转杯中加500μl预热ES medium，用枪轻轻吹匀并小心吸出液体，加入预先准备ES medium的10cm皿中，摇匀培养；
24h后吸出旧的培养基，1XDPBS清洗细胞碎片，后加入8ml新鲜ES培养急基；
48h后加puromycin（浓度为1.2—3.0μg/ml）进行筛选；
每天换液，约筛选6天开始挑取单克隆至48孔板中；
待7—9天克隆长起来后将其分别传代至24孔板中扩大培养；
约2—3天克隆成功扩增后每个孔取3/4细胞进行基因型鉴定，1/4细胞继续传代培养；
基因型鉴定完成后，即可根据细胞培养状态安排胚胎囊胚注射实验，并将注射后的胚胎移植到假孕母鼠体内；
待小鼠出生后鉴定子代嵌合体（chimera）形成情况，并通过子代嵌合体小鼠的交配繁殖获得能稳定遗传的小鼠。
图3. 利用ES细胞打靶获得基因编辑小鼠过程
注意细节：
ES细胞扩增培养阶段确保细胞质量，若细胞状态不佳可将细胞传一代后再培养；
ES细胞培养及电转过程中应确保环境洁净无污染，否则将导致细胞污染死亡；
电转时细胞数量不少于4x106，细胞数量太少导致电转后存活的细胞极少，影响阳性克隆筛选；
挑取单克隆前为保证环境条件良好，UV（紫外线）照射时间不少于2小时；
ES细胞囊胚注射对细胞质量要求较高，因此尽量选用代数靠前且状态较好的细胞株进行囊胚注射。
总之，胚胎干细胞培养需要更严格的环境，培养过程中一定要保证细胞不分化、不污染。在进行电转试验后应每天观察细胞状态，及时更换新鲜培养基，使ES细胞始终保持良好的生长状态。（关于ES细胞显微注射和基因型鉴定等技巧，我们会后续介绍，期待您继续关注我们动态。）
近10年来生命科学领域都有利用ES细胞基因打靶技术新建立各种疾病模型，为疾病机理研究、新药研发和治疗方案评价提供了宝贵的资源。早已经是一项生物分子学领域筒子们必备的技能。
或许希腊神话中的喀迈拉兽（chimera）不大可能会中成为实现，但利用ES细胞基因打靶产生的嵌合体（chimera）会为人类认识自我本质，攻克重大疾病提供不可或缺的资源。就让我们拭目以待吧！
