目的基因片段与载体连接
实验概要
本实验介绍了目的基因片段与载体连接的操作步骤，有助于学会DNA片段的体外连接技术。
实验原理
在Mg2 和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。
主要试剂
1. T4 DNA 连接酶
2. 连接酶缓冲液
3. 无菌ddH2O
主要设备
1. 旋涡混合器
2. 微量移液取样器
3. 移液器吸头
4. 1.5ml 微量离心管
5. 双面微量离心管架
6. 台式离心机
7. 干式恒温气浴
实验材料
1. pUCm-T 载体
2. Pinpoint™xa-3酶切载体
3. CHI插入片断
实验步骤
1. PCR产物与pUCm-T载体直接连接
1) 事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在14～16°C。
2) 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入：
4μl PCR 产物混合液
1μl pUCm-T载体
0.5μl T4 DNA连接酶(TAKARA, 350U/ul)
1μl 连接酶缓冲液
3.5μl ddH2O
总量 10μl 体系
3) 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C水中保温过夜。
4) 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
2. DNA回收片断(CHI)与载体(Pinpoint™xa-3)连接
1) 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入
4μl 回收DNA片断
1μl 酶切后回收的载体
0.5μl T4 DNA连接酶(TAKARA, 350U/ul)
1μl 连接酶缓冲液
3.5μl ddH2O
总量 10μl 体系
2) 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C干式恒温仪(或16°C水中)中保温过夜。
3) 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
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