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应用HPLC/MS/MS 高通量检测食品中多类有毒生物碱

2020.8.03

摘要：本应用简报介绍了一种简便的样品前处理方法，结合 Agilent 1290 Infinity II LC 和 Agilent 6470A 三重四极杆液质联用系统对食品基质中的多类生物碱进行高通量测定。采用基质匹配校准标样进行校正，发现在稀释的面包、牛奶、葡萄酒和米粉提取基质中，18 种生物碱在 0.50–50.0 µg/L 浓度范围内具有非常好的线性。考虑到 10 倍的稀释倍数，这相当于基质中 5.0–500 µg/kg。所有分析物的线性回归系数均大于 0.995。在 0.5 µg/L 的最低校准浓度下（相当于样品中 5.0 µg/kg），所有分析物的信噪比 (S/N) 均大于 10。在浓度为 5、50 和 250 µg/kg 的四种不同基质中，分析物回收率范围为 90%–110%，相应的相对标准偏差在 2.3%–7.9% 之间。结果表明，该方法具有很高的灵敏度、准确度和精密度。这种简单的样品前处理与快速 LC/MS/MS 检测相结合的方法可以用于食品基质中多类生物碱残留的高通量筛查。

前言：生物碱是一类具有含氮杂环结构的天然碱性物质。它们通常表现出很高的生物活性，是中药的主要成分。生物碱存在于一些植物中，意外摄入可能会造成有害影响[1]。根据欧盟法规 2016/239 (EU)，某些婴幼儿谷类食品中的莨菪烷生物碱（包括阿托品和东莨菪碱）的最大残留限量 (MRL) 低至 1 µg/kg[2]。在欧盟 No. 37/2010 (EU) 法规中，把秋水仙碱列入了禁止清单[3]。中国允许在所有动物源性食品基质中使用阿托品，并且未规定 MRL，国内也没有其它法规对食品基质中生物碱的含量进行限制[4]。然而，含生物碱的杂草意外混入农作物或家畜意外摄入含生物碱的杂草可能增加公众的暴露风险。因此，建立灵敏可靠的方法对食品基质中的生物碱进行常规监测至关重要。事实上，生物碱的物理化学性质差异很大，并且还涉及许多复杂的基质。开发一种可靠的方法来同时监测多种生物碱面临着较大的挑战。现有的报道主要集中在具有相似化学性质的生物碱的同时检测[5,6]。本应用简报提供了一种简单的样品前处理方法，结合快速 LC/MS/MS 方法，实现对牛奶、葡萄酒、面包和米粉等 4 种食品基质中的 5 类共 18 种生物碱的同时高通量测定。

实验部分：标样制备和样品前处理步骤所有 5 类共 18 种生物碱化合物均购自安谱科技公司（中国上海），用甲醇配制为 1.0 g/L 的储备液，于 –20 °C 下保存。然后用相应的基质提取物稀释储备液，得到校准标样溶液。将固体样品 (2.0 g) 加入 50 mL 离心管中，然后加入 5 mL 水进行水化。再加入 10 mL 乙腈，接着加入 5 mL Na2EDTAMcllvaine 缓冲液 (pH 3)。将离心管充分涡旋混合 2 分钟，然后在 7500 rpm 的转速下离心 5 分钟。收集上清液，经 0.22 µm 膜过滤后，用 LC/MS 进行分析。液体样品（如牛奶和葡萄酒）遵循相同的萃取程序，只是省去初始水化步骤。

液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪，配备如下模块： • Agilent 1290 Infinity II 二元泵，内置脱气机 • Agilent 1290 Infinity II 自动进样器，带针座反冲功能 • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱

结果与讨论：生物碱在酸性条件下很容易被质子化。因此，实验选择 ESI 正离子电离下的 MRM 扫描模式。实验中考察了不同的流动相组合，包括水/甲醇、水/乙腈、 0.1% 甲酸/甲醇和 0.1% 甲酸/乙腈。大多数生物碱在甲醇中比在乙腈中的响应更好。在酸化水中，色谱峰更窄、更对称且强度更高；而在非酸化水中，观察到峰拖尾且强度较低。因此，最终选择酸化的水/甲醇作为二元流动相。然后，在所选流动相条件下对 MRM 参数进行了优化。表 1 列出了得到的参数。对于那些色谱上未能得到理想分离的化合物，通过其特征 MRM 离子对可实现对化合物的准确定量。图 1 显示了来自不同类别的 18 种生物碱的典型 MRM 叠加色谱图。