关于人工染色体克隆载体的介绍
人工染色体克隆载体实际上是一种穿梭克隆载体,含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点,还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列,以及合适的选择标记基因。这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制,在体外与目的DNA片段重组后,转化第二受体细胞。
可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递,筛选第一受体的克隆子,一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子,常用与受体互补的营养缺陷型。与其他克隆载体相比,人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。
常见的人工染色体克隆载体主要有酵母人工染色体、细菌人工染色体载体和P1人工染色体载体等。
酵母人工染色载体(YAC)是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体,其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形,生长的代时为90min。YAC载体的复制元件是其核心组成成分,其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒(TEL)。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trpl、leu2涩和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3以及赭石突变抑制基因sup4等。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2一1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时,可抑制ade2一1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。
利用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。
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