T4 DNA聚合酶实验
T4 DNA聚合酶
实验材料 | DNA |
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试剂、试剂盒 | Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT |
仪器、耗材 | 水浴锅 |
实验步骤 |
一、50 μl 反应体积:
二、dNTp浓度的效应
1. 高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。
三、度的效应
用T4 DNA聚合酶标记3’末端时,反应温度保持在11℃,在较髙温度下,其外切酶活性易降解DNA模板。
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其他 |
一、缓冲系统的相容性
许多限制性内切酶能在T4 DNA聚合酶的缓冲系统进行切割反应,同时,T4 DNA 聚合酶也能直接使用。
1. 放射性标记DNA片段的3’末端,含5’凸出端的DNA片段及浓度为1~2 μmol/l 的适当[α-32P]dNTP,在11℃温育20 min。
2. 选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端,即所谓的“置换合成”。双链 DNA片段在dNTP存在下与T4
聚合酶温育,其3’末瑞的外切酶活性导致从 3’末端降解DNA,当补加4种dNTP后,可激活其聚合酶活性,延伸DNA镆板的3’末端。在T4
DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液,可获得最隹标记效果。
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