常用DAN探针制备的方法介绍--末端标记
末端标记(end labeling)是利用酶学方法或化学方法将标记物,如同位素、生物素、荧光素等标记到核苷酸链的5'或3'端制备探针。酶学方法中常用的酶有:经枯草杆菌蛋白酶水解大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ形成具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性而缺乏5'→3'外切酶活性的 Klenow 片段;具有5'→3'聚合酶活性和较强的3'→5'外切酶活性的 T4 DNA 聚合酶;具有催化 ATP 的磷酸转移到 DNA 或 RNA 5'-OH 末端的T4多核苷酸激酶;具有催化单链 DNA 或 RNA 5'-磷酸基团与单链 DNA 或 RNA 3'-羟基连接的 T4 RNA 连接酶等。采用化学方法将 RNA 3'端用过碘酸盐氧化,以一个二胺(或多胺)或细胞色素 c 为桥连接生物素,制备生物素标记探针。也有将合成寡核苷酸5'端制成酞菁衍生物,再与醛化酶结合制备酶标探针。
末端标记适用面广,可根据实验要求选择适宜的标记程序。例如要对带有 BamH Ⅰ酶切终点的 DNA 段进行末端标记,因 BamH Ⅰ切割DNA 所产生的末端是3'凹陷末端,反应时将带有3'凸出端的 DNA 片段与 dATP、dCTP、dTTP、Tris-HCl、MgCl2、DTT、NaCl、〔α-32P〕dGTP、Klenow 片段混合,22℃保温30min,70℃加热 10min 终止反应,经乙醇沉淀,溶于 TE 缓冲液即可作探针。
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