Omega质粒DNA中量提取流程
实验概要
Omega质粒DNA中量提取试剂盒说明书(E.Z.N.A. EndoFree Plasmid Midi Kit)。
主要试剂
1. 使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。
D6915-01:加入80ml无水乙醇
D6915-03: 加入200ml无水乙醇
D6915-04: 每瓶中加入200ml无水乙醇
实验步骤
1. 将带有质粒的E.coli 接种于30-50ml LB/抗生素培养液中，37°C搖床培养12~16 h；
2. 取30-50ml的菌液，室温下3，500-5，000xg离心10min收集细菌。
3. 倒弃培养基。加入2.5ml Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。
4. 往重悬混和液中加入2.5ml Solution Ii，轻轻颠倒混匀7-10次后可将混合液室温放置2min以提高产量。避免剧烈混和裂解液且裂解反应不要超过5 min。
5. 加入1.25ml 冰浴Buffer N3，并温和颠倒离心管数次至形成白色絮狀沉淀。准备好过滤器。
6. 把HiBind中量柱套在收集管中，加入2ml Buffer GPS至柱子中，静置3- 10min。室温3000-5000xg离心5分钟。去滤液，把柱子重新放回收集管中。
7. 将裂解液倒进预先准备好的针筒过滤器中(针筒开口朝上，下面出口处接收集管)，静置2min。
8. 插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。
9. 在过滤澄清的裂解液中加入1/10体积的ETR，颠倒7-10次后溶液变得浑浊，冰浴10-20min。
10. 42°C水浴5min后，25°C，3，000-5，000xg离心5min，ETR溶液将在管底形成蓝色分层。离心后，如果溶液中有大量的液滴悬浮，静置10分钟让液滴自然沉降。
11. 转移上清液移至离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇(室温)，混匀后室温静置1-2min。
12. 将HiBind®中量柱装在15ml收集管中。转移20ml混合液至柱子內，室温下3，000-5，000xg离心3-5 min，倒去滤液。
13. 重复该第12步骤，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。
14. 把柱子重新装回收集管，加入3ml HB Buffer，按上述条件离心，弃滤液。
15. 把柱子重新装回收集管，加入3.5ml DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃滤液。
16. 重复步骤15一次。
17. 弃去滤液，把柱子重新装回收集管，最大速度（< 6000xg）离心10-15min以甩干柱子基质。
18. （可选）进一步干燥柱子，将柱子从收集管中取出，用真空抽滤装置抽干柱子10min后，也可在真空烘箱或65°C 干燥10min后重复步骤17。
19. 把柱子装在干净的15ml离心管上，加入70°C预热的0.5-1ml Endotoxin free Elution Buffer到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），室温下静置2min后最大速度离心5min以洗脱DNA。
