Ⅰ型出血热患者中性粒细胞与淋巴细胞功能变化研究
作者：刘亦芬 高斌 刘琏
单位：刘亦芬（100091 北京, 中国中医研究院西苑医院检验科）；高斌（合肥市第一人民医院）；刘琏（安徽医科大学微生物教研室）
关键词：肾综合征出血热；中性粒细胞；淋巴细胞；Hantaan病毒
【 摘要 】 目的 研究肾综合征出血热（HFRS）患者的淋巴细胞和中性粒细胞免疫功能变化及其相互间关系，进一步阐明发病机理。方法 采用Ea、Et花环形成、PHA皮肤试验及中性粒细胞趋化、吞噬、NBT还原等多种试验方法同时对32例由Hantaan病毒引起的姬鼠型HFRS患者的淋巴细胞和中性粒细胞免疫功能变化及其相互间关系进行动态测定。结果 HFRS患者早期前五项指标均明显低于正常人(P＜0.01)；病程中，淋巴细胞损伤程度较粒细胞更加突出；中性粒细胞NBT还原能力在恢复期反降至最低 (P＜0.05)。此外，患者这两种细胞的免疫功能在恢复期并未能完全达到正常水平。结论 HFRS患者淋巴细胞免疫功能损伤程度与病程密切相关，可能是Hantaan病毒直接作用的结果；而中性粒细胞免疫功能变化比较复杂，有待进一步研究。恢复期患者细胞免疫功能未能完全恢复提示临床治疗应予以关注。
Research on functions of polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte in HFRS patients infected with Hantaan virus LIU Yifen*, GAO Bin, LIU Lian. *Xiyuan Hospital, Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100091
【 Abstract 】 Objective To clarify the pathogenesis of the hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), the investigations on the immune functions of polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte in HFRS were made.Methods The total and the activated erythrocyte rosette forming cell counts, phytohemagglutinin skin test, chemotactic and phagocytic activities as well as the nitroblue tetrazolium (NBT) dye reduction were respectively performed on 32 HFRS patients infected with Hantaan virus. A dynamic observation on the function change of the patients' polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte was done simultaneously. The statistical table and chart were given for the test results. The dynamic changes of polymorphonuclear neutrophil and lymphocyte's functions were showed schematically.Results The results showed that all these functional indices except for NBT of HFRS patients decreased sharply (P＜0.01) in febrile and oliguria phases compared with those of the normal group. Relatively, the activities of lymphocyte in HFRS patients were even more severely depressed. The reduction of nitroblue tetrazolium dye of polymorphonuclear neutrophil , however, was found to be lowest (P＜0.05) in the convalescence phase. Also in this phase, most of immune functions tested in present research were not perfectly recovered.Conclusions The functional changes of lymphocyte in HFRS are closely related with the patients' different phases (febrile, oliguria, diuria and convalescence). It is probable the direct role of Hantaan virus-infection. Further more investigations are required to clarify the immune functions of polymorphonuclear neutrophil in HFRS because of its complicate responses. Attentions in clinic should be paid to the patients in convalescence phase.
【 Subject words 】 Hemorrhagic fever with renal syndrome Polymorphonuclear neutrophil Lymphocyte Hantaan virus
近年来对肾综合征出血热（HFRS）发病机理的研究报道很多。多方面实验结果都证实了HFRS病人的细胞免疫和体液免疫功能的紊乱，表现为细胞免疫功能低下，体液免疫功能亢进〔1〕。但目前尚未见有文献报道对HFRS病人同时进行淋巴细胞（Lym）和中性粒细胞（PMN）功能变化的检测、比较及它们与病程内在关系的研究。我们采用多种方法对32例由Hantaan病毒引起的姬鼠型HFRS病人外周血中性粒细胞和淋巴细胞的功能同时进行了动态观察研究，并探讨了HFRS病人的病程与中性粒细胞及淋巴细胞功能之间的关系。为治疗及研究HFRS提供了实验参考。
材料和方法
1.检查对象： 选自安徽省凤台县人民医院内科住院病人，经临床及血清学检查确诊为HFRS患者(1992年)，经流行病学调查及分析（包括血清学及PCR分型）属由Hantaan病毒引起的Ⅰ型出血热。正常对照为疫区健康献血员。
2.外周血Lym和PMN分离方法：肝素抗凝血(25U/ml) 加2倍量的无钙镁Hanks液，混匀后叠加于淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）上2000r/min离心20分钟，收集单个核细胞层，无钙镁Hanks液洗2次，用含2%小牛血清的无钙镁Hanks液配成所需浓度的Lym悬液。同时沉淀细胞加等量3%右旋糖酐（上海长征制药厂，相对分子质量420×103）混匀后，置37℃，30分钟 后收集PMN层离心沉淀，Hanks液洗1次，加Tris-NH4Cl溶解残余红细胞，其余处理同Lym，配制成所需浓度的PMN悬液。
3.PHA皮肤试验：PHA（广州医药研究所生产）无菌生理盐水稀释成200μg/ml。取0.1ml 注射前臂皮内，24小时后测量红斑直径。
4.E花环试验：按全国统一操作流程并略加改进，具体步骤为： 1）Ea花环试验, Lym与绵羊红细胞（SRBC）比例1∶20，取Lym 悬液0.1ml加0.1ml SRBC悬液，混匀后立即1000r/min离心 5分钟 ，取出全部上清再返加2滴，轻轻摇匀后加入2滴0.8%戊二醛，置4℃冰箱固定15分钟，摊片、干燥、染色、油镜计数，算出Ea花环形成率； 2）Et花环试验，Lym与SRBC比例1∶60，等量Lym与SRBC悬液混匀，置37℃水浴中温浴10分钟后1000r/min 离心5分钟，置4℃冰箱过夜。以下步骤同上。
5.PMN吞噬试验：Pereira法和Wood法并加修改〔2，3〕。0.1ml白色念珠菌悬液（8×107/ml）加0.8ml PMN悬液（2.5×106/ml），加正常人血清0.1ml混匀，置37℃水浴1小时，1000r/min 离心5分钟，弃上清、沉淀细胞、摊片、油镜计数，算出PMN吞噬率。
6.PMN趋化试验：参照有关文献〔4〕，用3ml 1%琼脂糖（用Hanks液配制0.5%水解乳白蛋白）加热熔化至50℃时加0.3ml灭活小牛血清，混匀后铺于75.7mm×25.5mm载玻片上，冷却后打孔。每块板打上中下3行，每行6孔。上行加正常人混合血清10μl作趋化因子；中行加PMN悬液10μl(4×107/ml)；下行加Hanks液作对照，置湿盒内37℃温育6小时，室温干燥，固定，染色后镜检。用刻度目镜测微尺测量细胞趋化移动距离（A）和随机移动距离（B），算出趋化指数A/B。
7.PMN的NBT还原试验：参照文献〔5〕。
结果与讨论
从表1可见：HFRS患者发热期、少尿期的PHA皮肤试验红斑直径明显小于正常人，而到多尿期呈上升趋势，至恢复期接近正常水平；PMN趋化指数也在早期有明显降低(P＜0.01)，到多尿期和恢复期PMN趋化活性逐渐增强，且稍高于正常水平。但PMN的NBT还原能力则略有不同，在发热期接近正常水平，少尿期、多尿期呈下降趋势，但仍与正常组无显著性差异(P＞0.05)，可是到了恢复期PMN的NBT还原能力却明显低于正常组(P＜0.05)。
表1 HFRS病人PHA皮肤试验及PMN趋化、NBT还原功能检查结果
| Clinical
phase of HFRS patients | PHA skin test (mm) | PMN chemotactic index (A/B) | NBT reduction of PMN(△A) | ||||||
| n | x±s | P | n | x±s | P | n | x±s | P | |
| Febrile phase | 29 | 4.09±3.86 | ＜0.01 | 29 | 1.64±0.29 | ＜0.01 | 30 | 0.20±0.08 | ＞0.05 |
| Oliguria phase | 8 | 4.25±3.33 | ＜0.01 | 8 | 1.60±0.22 | ＜0.01 | 9 | 0.15±0.04 | ＞0.05 |
| Diuria phase | 23 | 6.89±3.79 | ＜0.01 | 22 | 2.20±0.28 | ＞0.05 | 22 | 0.15±0.07 | ＞0.05 |
| Convalescence | 11 | 9.81±4.58 | ＞0.05 | 15 | 2.10±0.19 | ＞0.05 | 15 | 0.13±0.03 | ＜0.05 |
| Normal group | 28 | 11.02±5.66 | 10 | 2.07±0.19 | 11 | 0.20±0.05 | |||
图1表明，HFRS病人在发热期Ea、Et花环形成率明显低于正常人(P＜0.01)，少尿期降至最低。Et花环形成率在多尿期、恢复期逐渐上升，接近正常水平；Ea花环形成率也在多尿期开始上升，但直到恢复期仍维持较低水平，且与正常组差异有显著性(P＜0.01)。而PMN吞噬功能测定表明，HFRS发热期较正常组有明显降低(P＜0.01)，以后迅速恢复到正常水平。
图1 HFRS病人各期淋巴细胞Ea、Et花环形成率及PMN吞噬能力与正常人比较
我们对实验结果进行归一化处理，即将正常对照组的Lym与PMN功能实验结果视为单位1，将HFRS病人在不同时期对应指标均值与正常对照组的相对比值分别绘点于图2和图3中，得到相应的动态变化图。从这些图中可直观看出HFRS病人在不同时期细胞免疫功能对应指标的变化。从中可分析：
图2 HFRS病人各期淋巴细胞免疫功能(Ea, Et以及PHA)动态变化与正常值比较
图3 HFRS病人各期中性粒细胞免疫功能(趋化、吞噬及NBT还原)动态变化与正常值比较
1.HFRS患者早期Ea、Et、花环形成率及PHA皮肤反应均较正常人迅速下降，尤以PHA皮肤反应最为突出，Ea次之。图2与图3相比可明显看出HFRS患者早期Lym受损程度较PMN更为显著，且与病程密切相关〔6〕。张学军〔7〕、王晶翼〔8〕等曾报道，HFRS病毒在体外能诱导正常人Lym产生化学发光，推测Lym表面存在HFRS病毒受体，Lym免疫功能受损可能是病毒的直接作用。本文结果进一步证实了这种推测。
2.HFRS患者PMN功能变化比较复杂（图3），早期PMN趋化及吞噬功能有所下降，以后迅速上升至恢复期甚至略高于正常水平。而NBT还原功能则随着病程的好转反而下降到最低点。造成这种现象的原因尚不清楚，但可以证明，PMN在HFRS整个病程中起着不可忽视的作用。至于HFRS患者PMN与Lym细胞免疫功能之间有何内在联系及它们在时相上有何关系，还需进一步研究。
3.图2和图3都显示HFRS患者无论是Lym还是PMN功能在恢复期仍未能完全达到正常水平，说明HFRS患者细胞免疫功能的恢复还需一段时间，提示临床治疗应予以关注。
参考文献
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