燕麦转基因及其在提高渗透胁迫耐受中的应用实验
实验材料：燕麦
试剂、试剂盒：
实验步骤：
1. 芽尖培养
( 1 ) 成熟的燕麦（Ogle、Pacer 和 Prairie ) 种子用于芽尖培养。
( 2 ) 徒手去除种子的外稃和内稃。
(
3 ) 种子用 70% 乙醇（Sigma) 浸泡 5 min 进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水洗一次，再用 20% 的 Clorox
漂白剂浸泡，并在旋转振荡器上以 0.5 g 持续振荡 30 min (VWR International, Bristol, CT
06011) (见注 1) ，用无菌蒸馏水洗二次。
( 4 ) 在无菌条件下将种子放入装有湿润滤纸的培养皿后，覆盖一层湿滤纸，将培养皿在 3~5°C 放置 2~3 天以使种子适应处理条件。期间要经常加水保持湿度。
( 5 ) 放置结束后，将 10~12 粒经过消毒的种子放入倒有 MSI 培养基的（25 mL/每皿）无菌培养皿（100 mm x15 mm，直径x高；VWR ) 中萌发，在生长室或 25°C 生长箱中暗培养一周（见注 2) 。
( 6 ) 种子萌发后，用无菌的刀片（Sigma) 将芽尖切成 3~5 mm 的小段（见注 3) 。
( 7 ) 将 5~7 个切好的芽水平放置在倒有 MS2 培养基的培养皿中（100 mmx15 mm ) ，在 25°C 持续光照条件下培养4 周 [ 60 μmol/( m2·s ) 采用 40W 功率的冷白光 Econ-owatt 荧光灯管，Philips Westinghouse, USA ] ( 见注 4 ) 。
( 8 ) 每周进行一次继代培养，从培养的芽尖将伸长的叶片、胚芽鞘和茎移除，然后再切成 3~5 mm 的小段。
( 9 ) 每 2 周用 MS2 培养基进行继代培养以保持丛生芽的生长 [ 图10.2 (a ) ]。
( 10 ) 培养 8 周后计算每一品种丛生芽的相对分化频率，即产生丛生芽的芽尖数与培养的总芽尖数的百分比（见注 5 ) 。
2. 微粒轰击
( 1 ) 取 30 mg 金粉或钨粉置于 1.5 ml 离心管（VWR) ，加入 1 ml 100% 乙醇髙速涡旋振荡 30 min 进行消毒，用于基因枪轰击。
(
2 ) 在振荡过程中，取 50 μl 微粒乙醇悬浮液到新的离心管中，并用微量离心机(Brinkman, Westbury， NY
11590) 10000 g 离心 30s，然后加入 1 ml 蒸馏水，涡旋振荡洗涤并离心。洗两次后，用 332 μl 无菌蒸馏水重悬微粒。
( 3 ) 在重悬的微粒中加入 15 μl DNA 样品，其中含有 15 μg 阳摩尔比为 1 : 1 的 pBY520 和 pActl-D 质粒、225 μl 的 2.5 mol/L CaCl2 (Sigma) 、50 μl 0.1 mol/L 亚精胺 (Sigma) ，室温下涡旋振荡 5 min (见注 6) 。
( 4 ) 将微粒- DNA 悬浮液在冰上放置 10 min，然后 10000 g 离心 1 min。
( 5 ) 用 500 μl 100% 乙醇清洗微粒-DNA 沉淀，涡旋振荡 30s，离心 1 min，然后用 100 μl 100% 乙醇重悬微粒。
( 6 ) 根据大小将 2~3 个丛生芽放置在铺有 MS3 培养基（25 ml/皿）的培养皿中直径为 1.5 cm 的区域内，然后将培养皿放在基因枪的终止屏下方（见注7) 。
( 7 ) 吸取 10 μl 微粒-DNA 悬浮液加在载体膜（macrocarriers) 中心，待乙醇挥发后立即用于轰击（见注 8) 。
( 8 ) 2 h 后对每一个芽尖培养物再进行一次轰击（见注 9) 。
( 9 ) 将轰击后的芽尖移到新鲜的 MS2 培养基上（25 ml/皿），在 25°C 持续光照 [ 60 μmol/( m2·s )] 条件下生长 4 周，期间进行一次继代培养 [ 图 10.2 ( b ) ]。
3. 转基因组织的选择
( 1 ) 4 周后，将基因枪轰击过的丛生芽分成直径 5~10 mm 的小块（避免损伤芽分生组织），然后每皿放 6~8 个芽丛于 MS4 培养基上（25 ml/皿；100x15 ) ，并计算转基因事件的相对发生频率（表 10.1)。
( 2 ) 2 周后，将转基因的芽（绿色的）在新鲜的 MS4 培养基上进行继代培养，去除非转基因的芽（黄色或褐色）。
( 3 ) 在 MS4 上选择培养 4 周后，将绿色的丛生芽分成直径为 5~10 mm 的芽丛，在 MS5（25 mL/皿，100x20 ) 培养基上继代生长 4~6 周。
(
4 ) 经过总共 4 个月的选择和增殖后，将快速生长的丛生芽移至带有 MS6 培养基（50~70 ml/Magenta) 的 Magenta
盒（99 mmx 68 mm，长X直径，Sigma；2~3 芽丛/Magenta) 中进行营养生长，然后移至 MS7（50~70
ml/Magenta) 培养基中进行生根培养 [ 图 10.2 ( c ) ]。
( 5 ) 当转基因植株长到 5~10 cm
高、有 2~3 个叶片时，移植到含混合土的 8 cm 塑料罐中，其中泥炭和珍珠岩按 1 : 1 混合，每罐一棵。在 16 h
光周期、70%~80% 湿度的温室中生长直到成熟 [ 图10.2 (d) ; 见注 10]。
( 6 ) 让转基因植株自花授粉结实，收种，按株系独立保存在 4℃ 和 70% 湿度的环境中。
4. 转基因遗传分析
( 1 ) 低温处理后，种子（每皿 10~12 粒）在 MS7 ( 25 ml/皿）培养基上萌发 1 周，用于分析转基因的遗传特性，如在 R。、R1、R2 代中 bar 基因的遗传稳定性（见注 11)。
( 2 ) 或者在温室中，利用多孔塑料盘（Griffin Green House and Nursery Supplies) 在土中（Metro Mix 360 Soil) 萌发种子并生长 2 周。用除草剂喷洒生长的植株（见注12)。
( 3 ) 1 周后，统计选择培养基上萌发和未萌发的种子数，或温室中除草剂处理后存活和死亡的植株数。
( 4 ) 采用 X2 检验（53 ) 分析转基因在 R。、R1、R2 代的分离（表 10.2)。
5. 转基因植株的分子检测
(1) 聚合酶链反应（PCR)
①
转基因植株中转基因的检测（如 bar 和 hav1) : 用叶片遵照 REDExtract- N-Amp Plant
PCR试剂盒（Sigma- Aldrich， St. Louis, MO, Cat# XNA- P ) 的说明书操作提取 DNA。
②
使用正向（F ) 和 反向（R ) PCR 引物：例如，bar- F：5'-ATGAGCCCAGAACGACG-3'；bar-
R：5'-TCA GATCTCGGTGACGG-3'；hva1-R：5' -TGGCCTCCAACCAGAACCAG-3'；hva1-
R：5'-ACGACTAAAGGA ACGGAAAT-3’。
③ 在 PCR 仪（如 Per-kin
Elmer/Applied Biosystem， Foster City, CA) 上进行 DNA 扩增。扩增反应起始用 94°C 变性
4 min，随后 94°C 1 min、55°C 1 min、72℃ 2 min 进行 35 个循环，最后 72°C 延伸 10 min。
④ 在 0.8% (m/V) 的琼脂糖凝胶分离并分析 PCR 产物，凝胶用 EB 染色后在紫外灯下观察。转基因条带大小分别是： bar 为 0.59 kb，hva1 为 0.70 kb [ 图 10.3 ( a ) ]。
(2) Southern 杂交分析
① 用基因编码区（如 hva1 或 bar1 ) 序列作为探针进行 Southern 杂交 [54]。
② 用 Phytopure 植物 DNA 提取试剂盒（Amersham-Pharmacia Biotech) 提取转基因和非转基因植株的基因组DNA。
③ 用 10 μg R0、R1 和 R2 代植株的基因组 DNA 进行 Southern 杂交分析。
④ 用 HindIII 和 HindIII-BamH I 限制酶酶切消化基因组 DNA，然后在 0.8% 的琼脂糖胶上电泳分离片段。
⑤ 将胶变性和中和并印迹到 Hybond-N+ 膜上（Amersham-Pharmacia Biotech) , 依照 Sambrook 等描述的方法[55]。
⑥ 用 HindIII-BamH I 酶切 pBY520 质粒，在 0.8% 的低熔点胶上分离带有 hva1 编码区的片段。切下 1.0 kb 的片段，用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化该片段。
⑦ 用 Rad 引物标记试剂盒（GIBC0 BRL) 对纯化的基因特异的 DNA 片段进行 [ 32P] -dCTP 放射性标记，方法参照说明书。
⑧ 按照标准程序[ 55 ] 用 hav1 基因特异探针与准备好的膜进行杂交。
⑨ 随后，-80°C 条件下用 X 光胶片（Kodak ) 放射自显影分析杂交膜 [ 图10.3 ( b )]。
(3) Northern 杂交分析
① 用 TRIZOL (GIBCO BRL) 提取转基因和非转基因植株幼叶的总 RNA，方法参照说明书。
② 依照 Sambrook 等的方法在 1.2% 的琼脂糖-甲醛变性胶中电泳分离 10 μg 总 RNA [55]。
③ 依照 Sambrook 等的方法将股印迹到 Hybond-N+ 尼龙膜（Amersham-Pharmacia Biotech) 上 [55]。
④ 按照标准的 Northern 杂交程序 [55]，用 32P 标记的基因特异的探针分析 hva1 的转录情况 [ 图 10.3 ( c ) ]。
(4) Western 杂交分析
① 蛋白质提取、Western 杂交和免疫检测参照 Xu 等的方法[48]。
② 在液氮中研磨约 0.1 g 转基因和非转基因植株的新鲜叶片，加入 0.2 ml 蛋白提取缓冲液提取蛋白质。
③ 用 Bio-Rad 蛋白分析试剂（ Bio-Rad) 按 Bradford 的方法测定每一样品的总蛋白浓度 [56]。
④ 用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 100 μg 转基因和非转基因样品的可溶性总蛋白。
⑤ 电泳结束后，使用半干转移系统（ Bio- Rad ) 将蛋白质电转到硝酸-纤维素膜上(Amersham-Pharmacia Biotech) ，方法参照仪器说明。
⑥ 将 Western 膜分别和转基因特异蛋白（如 HVA1 ) 免疫产生的一抗（ 如兔抗血清）及二抗（带有碱性磷酸酶的兔 IgG 的抗体，Sigma- Aldrich) 孵育。
⑦ 在碱性磷酸酶的缓冲液中进行膜显色 [ 图10.3 ( d ) ]。
6. 转基因的生化分析
( 1 ) 对转基因和非转基因植株的整株或不同的器官进行转基因的生化分析，如 GUS 分析（图 10.2 (e )~（h ) ; [ 48 ] ) 。
( 2 ) 为去除叶绿素，将绿色组织先在 70% 乙醇中浸泡 2 h，然后在 100% 乙醇中过夜处理（此步骤应在在 37℃ 孵育后进行）。
( 3 ) 抽真空以去除组织中的气体。
( 4 ) 将样品浸入 GUS 底物中 [ 10 mmol/L EDTA (pH 7.0 ) 、0.1 mol/L NaPO4 (pH 7.0)、1~5 mmol/L X-Gluc；X-Gluc 可溶解在二甲基亚砜中；Sigma] , 抽真空后立即在 37°C 孵育（57 ) 。
( 5 ) 为了观察 GUS 表达部位，制作徒手横切片，然后在 Zeiss SV8 体视镜或 Zeiss Axioskop 常规显微镜下观察。
7. hva1 转基因植株在胁迫条件下的评价
(1) 离体培养条件下的盐胁迫
①
取转基因和非转基因每个株系 50 或 60 粒种子的种子；见注 12) 进行表面消毒。每皿 MS7 培养基（25 ml/皿）上播 10~12
粒种子，于 25°C 暗培养萌发 4 天（见注 13)。非转基因的种子用不加草胺膦或双丙胺膦的 MS7 培养基。
② 将萌发种子分为两组，一组不加盐胁迫而另一组生长在盐胁迫条件下。
③ 从每一独立的转基因和非转基因株系中移出 4~5 棵正在生长的苗到加有 NaCl 或没有 NaCl 的 MS8 培养基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25°C 和 60 μmol/( m2·s ) 的光照条件下生长。最少 4 个重复。
④ 6 天后，观察转基因和非转基因植株在加盐和不加盐条件下的生长状况 [ 图 10.2 ⑴ ] 。
⑤ 进行了测定，如植株鲜重（见注 14 )、株局、根长、干 重（见注 15；表 10. 3) 。
⑥ 对数据进行方差分析 [58]。
⑦ Tukey's 差距检测法在 95% 置信度水平上比较均值。
⑧ 将植株移栽至泥炭：珍珠岩（1 : 1，V/V ) 混合的混合土中，并在温室中进一步生长。
(2) 温室（盆播）条件下的盐胁迫
① 依照 3.7.1 节中的方法在 MS7 培养基上萌发种子。
② 将 1 周大小经过筛选的转基因苗和非转基因对照苗移到小盆（8 cmx 4 cmx 6 cm) 中的混合土中，该混合土中泥炭：珍珠岩为 1 : 1 (每盆一株苗）。
③ 将这些盆放在加水的平底盘中，并在温室中生长 1 周。
④ 将生长中的苗分成 5 组，每组中转基因和非转基因株系分别取 8~10 棵苗。在盐胁迫处理前测定每一株的株高和叶数。
⑤ 用不同浓度的盐溶液 （0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L 和 200 mmol/L NaCl) 浇灌植物，每天一次持续 14 天（见注 16)。
⑥ 随后用水浇灌 1 周让植株恢复。
⑦ 之后，重新不间断进行 5 周盐胁迫处理。
⑧ 实验至少进行 4~5 次重复。
⑨ 测定单株株高、根长、分蘖数、单株结实率。比较转基因和非转基因植株在胁迫和非胁迫条件下的生长差异 [见注 1 7 ; 图 10. 2( j ) 和图 10. 2 ( k ) ] 。
⑩ 对数据进行方差分析统计 [58]。
⑾ Tukey's 差距检测法在 95% 置信度水平上比较均值（表 10.4 ) 。
(3) 离体培养条件下缺水或渗透胁迫
① 参照 3. 7 .1 节的方法，在 MS7 培养基上萌发种子（R。、R1 、R2) (见注 18)。
② 将萌发的种子分成两组：一组生长在不缺水或没有渗透胁迫的条件下，另一组生长在缺水或有渗透胁迫的条件下（见注 19)。
③ 将每一独立的转基因和非转基因株系的 4~5 株苗移到 Magenta 盒中加有甘露醇或没有甘露醇的 MS9 培养基上（50~70 ml/Magenta) ，在 25℃ 光照条件下生长。最少 4~5 个重复。
④ 6 天后，分析转基因和非转基因植株在渗透胁迫和非渗透胁迫条件下的生长状况。
⑤ 和盐胁迫条件下一样对植株的生长状况进行测定。比较转基因和非转基因植株在胁迫和非胁迫条件下的生长差异（表 10. 3) 。
⑥ 将植株移栽到混合土中，其中泥炭与珍珠岩按 1 : 1 ( V /V ) 混合，使其在温室中进一步生长。
(4) 温室（盆播）条件下缺水胁迫实验
① 参照 3. 7 .1 节的方法，在 MS7 培养基上萌发 30~40 粒种子(见注 20)。
② 将 1 周大小的、经过筛选的转基因苗与未经筛选的非转基因苗作对照，移到装有混合土的小盆中（8 cmx4 cmx6 cm) ，该混合土为泥炭与珍珠岩 1 : 1 混合，每盆栽一株苗。
③ 将盆放置于加水的平底盘中，缺水处理前让植株在温室中生长 2 周。
④ 将植株分成加水（a 组）和缺水（b 组） 两组，每一组中转基因和非转基因株系各用 8~10 棵苗。在胁迫处理前测定每一株的株高和叶片数。
⑤ 在 a 组植株的平底盘中加水，持续 1 周。
⑥ 在 b 组植株的平底盘中只加水 2 天。
⑦ 加水 2 天后，完全去除 b 组平底盘中的水，以后的 1 周内处于缺水环境。
⑧ 重复这一过程 5 周。
⑨ 结束后，测定每一株的株高分蘖数。比较转基因和非转基因植株在胁迫和非胁迫条件下的生长差异。
⑩ 用方差分析进行数据统计 [58]。
⑾ Tukey's 差距检测法在 95% 置信度水平上比较均值。
