干货∣细胞转染效率低下的八个大坑
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低下却是实验狗们经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，更是因为难度大，号称谁碰谁死，而令人谈虎色变。不，应该是谈原代细胞色变。
细胞转染的protocol教科书和实验手册上面都有，毛博不想再重复了。这里，毛博根据自己做细胞转染近10年的经验和体会，总结出了导致转染效率低下的八个大坑，以及避免掉坑里的一些做法。都是干货哟。
1.准备不足
做脂质体转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间等等。
2.电压过大
做电转的时候，如果电压太大，往往会发生细胞大量死亡的情况。不同的细胞，需要的电压是不一样的。这就要求我们多做预实验，多摸索条件。对于大多数细胞来说，其最佳电压位于250-1250v/cm。另外，就是进行转染的细胞应该处于对数生长期。处于对数生长期的细胞的抗损伤能力是最强的。细胞浓度应该处于5x106到1x107／mL之间。每次转染的质粒应该控制在4-6 μg，如果﹥10μg，转染效率也大大降低。电击后，应该将DNA和细胞混合液在室温下放置10分钟，使细胞恢复损伤。
3.试剂过期
有时候转染效率低下，还要考虑会不会存在试剂过期的情况。毛博当年做转染整整半年，百思不得其解。最后发现，原来是Lipofectamine 2000过期了。换了之后，立马成功。根据我的经验，尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000，因为过了半年后，就算没有过失效期，但是细胞毒性大大增加，而转染效率却大大下降。千万不要为了省钱，影响实验进度哈。
4.未加血清
转染后未及时加入血清，会导致细胞大量死亡。一般要在转染后的4-6小时换液且换为有血清的培养基。根据毛博的经验，其实也可以在原来的无血清培养基里面滴加血清。这个时候，最好不要换液，不要打扰细胞，让它安安静静地休息。但是也不能过早加入血清。过早的话，会引起未转染的细胞疯狂生长。那么，什么是最佳时机呢？在20%的细胞变圆的时候，就是加血清的最佳时机。
5. 细胞污染
细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。毛博这里再贡献一个独门绝招：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。
6.质粒不行
转染用的质粒首先要保证数量，一般为2 μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，也会影响转染效率。这个时候，就应该对质粒进行纯化和浓缩。
7.不注意细节
在转染之前更换一次37℃预温的培养基，可提高转染效率。脂质体和DNA/RNA混合物应当一滴一滴地滴下来，从培养皿一边滴到另一边，边滴边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。这些都是一些细枝末节，但是，如果不注意的话，也会造成转染效率低下。
8.细胞状态不好
细胞状态不好，会导致转染效率低下。一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6X105个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。转染的整个过程都不应该有抗生素。
细胞转染是个细活。稍微不小心，就会掉坑里。以上，毛博介绍了一些自己的心得体会。希望广大的实验狗们能够避免这些毛博当年踩过的大坑，早日出成果，早日出文章。
