一步法TUNEL细胞凋亡检测技巧及常见问题分析
1. 对于贴壁细胞或细胞涂片：
a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用碧云天生产的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入碧云天生产的免疫染色强力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟。
f. 转步骤5。
2. 对于悬浮细胞或细胞悬液：
a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用碧云天生产的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用碧云天生产的免疫染色强力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS重悬细胞，室温孵育5分钟。
e. 转步骤5。
3. 对于石蜡切片：
a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2
分钟。
b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K(推荐使用碧云天的 蛋白酶K(20mg/ml)，用免疫染色洗涤液或10mM
Tris-HCl
pH7.4-7.8稀释1000倍即为20μg/ml不含DNase的蛋白酶K)，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 转步骤5。
4. 对于冰冻切片：
a. 用碧云天生产的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。
c. 加入含碧云天生产的免疫染色强力通透液或含0.5% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟。
d. 转步骤5。
5. 配制TUNEL检测液：
参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。
| 1个样品 | 5个样品 | 10个样品 | |
| TdT酶 | 5μl | 25μl | 50μl |
| 荧光标记液 | 45μl | 225μl | 450μl |
| TUNEL检测液 | 50μl | 250μl | 500μl |
6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片：
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 在样品上加50μl
TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：50μl
TUNEL检测液适合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一个孔，如果是6孔板中的一个孔TUNEL检测液宜使用100μl。如果待检测的样品为涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL检测液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL检测液蒸发，并且使TUNEL检测液均匀覆盖样品。自行裁剪圆片时需要连着圆片突出一个角或连着一条，并将圆形之外的突出部分折叠，方便染色结束后利用突出部分顺利取出圆片。也可以用PAP
Pen圈出一个区域进行染色。孵育时需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入适量水以保持湿润，从而尽量减少TUNEL检测液的蒸发
c. PBS或HBSS洗涤3次。
d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。染色效果可参见图1。
7. 对于悬浮细胞或细胞悬液：
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。
c. PBS或HBSS洗涤2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。
e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
常见问题：
1. 出现非特异性荧光标记。
a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。
c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。
2. 荧光背景很高。
a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。支原体染色检测试剂盒可以向碧云天订购。
b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。
d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
3. 标记效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。
c. 荧光淬灭。荧光在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
e.
贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会使发生凋亡细胞的贴壁性会减弱，所以建议在凋亡诱导结束后，用可以对多孔板进行离心的离心机1000g离心5分钟，然后再吸除培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时洗去。后续整个操作也需要轻缓。
