高速逆流色谱技术分离决明子中蒽醌类化合物
传统的决明子中蒽醌类化合物的主要分离方法是柱色谱法[10-12]。柱色谱法的固定相一般是固态物质，会对被分离样品中的成分产生不可逆吸附作用。而HSCCC是一种液-液分配色谱技术，其固定相是液体，不存在不可逆吸附现象。并且HSCCC相较于柱色谱法还具有进样量大、成本小、操作简单、回收率高等优点。Yang等用6次HSCCC分离从决明子乙酸乙酯部位中分离到9种化合物[13]，分离次数多，操作繁琐。本研究对决明子中乙酸乙酯部位进行了碱液萃取的操作，除去更多的杂质，然后再应用HSCCC技术分离决明子中的蒽醌类物质，利用2次HSCCC方法得到了7种化合物，7种化合物结构式见图1，实现了快速分离。
1材料与方法
1.1原料与试剂
决明子，购自济南市中鲁医院；用于制备决明子粗提物用的乙醇为工业乙醇，萃取和逆流色谱分离用的试剂如石油醚、乙酸乙酯、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯；高效液相色谱用甲醇为色谱纯，美国天地公司生产；水为娃哈哈纯净水。
1.2主要仪器与设备
TBP300A型高速逆流色谱仪，包括多层聚四氟乙烯螺旋管（直径2.3 mm，分离体积300 mL，β值为0.5～0.8），上海同田生物技术有限公司生产；TBP5002泵、8823B-紫外检测器，北京宾达英创科技有限公司生产；3057-11 记录仪，重庆川仪总厂有限公司生产；Waters 600-996高效液相色谱系统，配有光电二极管阵列检测器（PDA），美国Waters公司生产。
1.3试验方法
1.3.1决明子原材料的鉴定取决明子粉末1 g，加甲醇 10 mL，浸渍1 h，过滤；滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，再加盐酸1 mL，置水浴锅上加热30 min，立即冷却，用乙醚提取2次，每次20 mL；合并乙醚液，蒸干，加三氯甲烷2 mL溶解残渣，得到供试品溶液。取大黄素、大黄酚对照品，分别加甲醇制成每1 mL各含0.25、1.00 mg的溶液，作为对照品溶液。展开剂为石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（体积比15 ∶ 5 ∶ 1）的上层溶液，点板展开，结果见图2。决明子样品中与对照品有相同的Rf，结合决明子的性状等特征，鉴定该决明子药材是决明子（Cassia obtusifolia L.）。
1.3.2决明子粗提物的制备取决明子药材 0.7 kg，粉碎，置于5 000 mL 圆底烧瓶中，加入10倍量95%的乙醇，加热回流提取3次，每次2 h。抽滤后合并滤液，减压浓缩，得稠浸膏，用水复溶。用等量的石油醚萃取3次，弃去石油醚相。再用等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至800 mL，将浓缩液用5%的NaOH溶液萃取3次，萃取液用盐酸调节pH值为2～3。再用乙酸乙酯萃取酸水液3次，将萃取液减压
浓缩至浸膏状，得到17.3 g决明子粗提物，置于4 ℃冰箱内用于进一步分离。
1.3.3两相溶剂体系及样品溶液的制备HSCCC所用的溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2和3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5），按比例分别置于2 L分液漏斗中，剧烈振荡使充分混合，于室温下静置分层。使用前分出上下相，超声脱气10 min。 HSCCC样品溶液的制备：取决明子粗提物200 mg，加入体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2 的上下相各5 mL，超声使其完全溶解即得。取含有成分Ⅱ和Ⅳ的混合组分A 20 mg，加入体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5） 的上下相各5 mL，超声将其全部溶解即得。
1.3.4分配系数KD的测定溶剂系统的选择是根据目标化合物的分配系数（KD）确定的，当两相溶剂体系达到平衡后，将适量的粗样溶解在1 mL下相中。经HPLC测定目标化合物在下相中的峰面积，记录为A1。然后加等量的上相，完全混合均匀，平衡后经HPLC再次测定目标化合物在下相中的峰面积，记录为A2。分配系数（KD）由下列公式确定：KD=（A1-A2）/A2。
1.3.5HSCCC的分离过程将已超声脱气的上相（固定相）以20 mL/min的流速泵入螺旋管中直至有上相流出，以保证固定相充满分离螺旋管，打开主机，使色谱仪螺旋管柱按顺时针方向旋转，当转速达到850 r/min并稳定后，以2.0 mL/min的流速将下相（流动相）泵入分离螺旋管中，待流出的上相体积恒定（即下相流出时）平衡完毕，进样，打开紫外检测仪和记录仪。检测波长为280 nm。
1.3.6HPLC分析HPLC分析条件：色谱柱：Intersil ODS-SP （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：A：乙腈，B：水。梯度洗脱：0～15 min，A：40%～70%，15～25 min，A：70%，25～30 min，A：70%～100%，30～40 min，100%；流速：1 mL/min。检测波长：285 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2结果与分析
2.1溶剂体系的选择
溶剂体系的选择是HSCCC分离的难点，也是最关键的部分。HSCCC分离的溶剂体系必须在充分混匀后快速地分层（不超过30 s）；有较高的样品溶解量和固定相保留量；而成功的HSCCC溶剂体系还要求各目标化合物在溶剂体系中有合适的分配系数。所以溶剂体系的选择可通过分配系数KD值的测定来确定。一般来说，KD值的最适范围是0.5～2.0。若KD≤0.5，说明目标化合物的保留值偏低，出峰太快，各组峰之间的分离度较差。若KD≥2.0，说明目标化合物的保留值较高，虽然能够实现分离，但出峰时间较长，且峰形较宽。若0.5 2.2HSCCC分离决明子粗提物
用选定的溶剂体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2），按照“1.3.4”节所述的方法对大黄蒽醌提取物进行分离纯化。称取0.2 g提取物，按照“1.3.2”节中所述的样品溶液制备方法对样品进行处理。根据“1.3.4”节所述的方法进行分离，结果得到化合物Ⅰ 26 mg、化合物Ⅲ 11 mg、混合组分A 20 mg（主要含化合物Ⅱ和Ⅳ）、化合物Ⅴ 23 mg、化合物Ⅵ 19 mg、化合物Ⅶ 9 mg。决明子粗提物HSCCC分离见图3。图中每个阴影与所标出的成分相对应，而馏分A中主要含有化合物Ⅱ和Ⅳ，有待进一步进行HSCCC分离。用选定的溶剂体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5），按照“1.3.4”节所述的方法对混合组分A进行分离纯化。将20 mg混合组分A，按照“1.3.2”节中所述的样品溶液制备方法对样品进行处理。根据“1.3.4”节所述的方法进行分离，结果得到化合物Ⅱ9 mg和化合物Ⅳ 2 mg。混合组分A的HSCCC分离见图4。
2.3化合物的纯度检测和结构鉴定
为分析决明子粗提物中各成分的HPLC图谱，分别测试了不同浓度和组成的流动相，包括甲醇-水、乙腈-水 、乙腈-0.1%磷酸水溶液系统以及梯度洗脱等。结果表明，流动相用乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液相似且效果最佳。本试验选用乙腈-水体系，梯度洗脱的方法如“1.3.6”节所述。决明子粗提物和化合物Ⅰ～Ⅶ的HPLC见图5，经测定分离得到的各组分的纯度分别为99.7%、96.4%、91.0%、953%、98.7%、97.9%、95.8%。
化合物Ⅰ：ESI-MS，m/z：329[M-H]-，分子式：C17H14O7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.33（3 H，s）、3.90（3 H，s）、3.97（3 H，s）、4.90（3 H，s）、7.16（1 H，s）、7.79（1 H，s）。以上数据与文献报道结果[14-17]基本一致，确定化合物Ⅰ为橙黄决明素。
化合物Ⅱ：ESI-MS，m/z：285[M-H]-；分子式：C15H10O6；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：3.16（3 H，s）、6.46（1 H，d，J=2.4）、7.06（1 H，d，J=2.4）、7.52（1 H，s）。以上数据与文献报道结果[14]基本一致，确定化合物Ⅱ为alaternin。
化合物Ⅲ：ESI-MS，m/z：299[M-H]-；分子式：C16H12O6；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.33（3 H，s）、3.70（3 H，s）、6.56（1 H，d，J=2.4）、6.95（1 H，J=2.4）、7.76（1 H，s）、13.25（1 H，s）。以上数据与文献报道结果[11]基本一致，确定化合物Ⅲ为1-甲氧基-2-羟基大黄素。
化合物Ⅳ：ESI-MS，m/z：357[M-H]-，327[M-OCH3]-；分子式：C19H18O7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.27（3 H，s，3-CH3）、3.80、3.86、3.87、3.98（各3 H，s，1，6，7，8-OCH3）、7.50（1 H，s，H-5）、7.73（1 H，s，H-4），以上数据与文献报道结果[16-17]基本一致，确定化合物Ⅳ为黄决明素。 化合物Ⅴ：ESI-MS，m/z：283[M-H]-；分子式：C16H12O5；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.30（3 H，s）、3.82（3 H，s）、7.31（1 H，d，J=1.2）、7.63（1 H，d，J=1.2）、7.72（1 H，s）、7.8（1 H，s）、12.82（1 H，s）。以上数据与文献报道结果[15]基本一致，确定化合物Ⅴ为美决明子素。
化合物Ⅵ：ESI-MS，m/z：343[M-H]-；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.27（3 H，s，3-CH3）、3.34、3.80、3.98（各3 H，s，1，6，7-OCH3）、7.31（1 H，s，H-5）、7.80（1 H，s，H-4）、13.08（1 H，s，8-OH）。以上数据与文献报道结果[16-17]基本一致，确定化合物Ⅵ为决明素。
化合物Ⅶ：ESI-MS，m/z：268.8[M-H]-；分子式：C15H10O5；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.44（3 H，s）、6.56（1 H，d，J=2.4）、7.10（1 H，d，J=2.4）、7.10（1 H，s）、7.57（1 H，s）。以上数据与文献报道结果[15，18]基本一致，确定化合物Ⅶ为大黄素。
3结论
应用HSCCC分离方法，可从决明子中成功地分离出7种高纯度的蒽醌类成分，其纯度分别为99.7%、96.4%、91.0%、95.3%、98.7%、97.9%、95.8%。高速逆流色谱操作简单，快速高效，重现性好。特别是多种溶剂体系相结合以及HSCCC和多种分离方法相结合的思路，对天然植物资源中活性成分分离纯化具有很好的应用价值，也可为具活性植物特别是中草药质量控制所需要高纯度物质对照品的制备提供一种高效实用的方法。
