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植物RNA提取实验——液氮研磨法

2019.3.27

实验方法原理	独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H₂O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
实验材料	植物组织
试剂、试剂盒	β-巯基乙醇乙醇蛋白液RW1 漂洗液RW 蒸馏水无菌水
仪器、耗材	离心管离心机移液器移液管枪头盒针头注射器吸附柱液氮罐
实验步骤	一、取500 ul裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇)，转入1.5 ml离心管中，加入50 ul PLANTaid混匀备用。二、液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50 mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物，但是淀粉含量高的植物不能温育，因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。三、用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9 mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。四、将裂解物13，000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转到一个新离心管。五、较精确估计裂解物(上清)体积，加入0.5体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。六、将混合物(每次小于700 ul，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm离心60秒，弃掉废液。七、加700 ul 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟后再离心。八、加入500 ul漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500 ul漂洗液RW，重复一遍。九、将吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。十、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 ul RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，12 000 rpm 离心1分钟。十一、如果预期RNA产量>30 ug，加30-50 ul RNase free water重复步骤七，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。