细胞培养技术-2
◇湿热消毒的注意事项
①不可用安全阀摘子排气。
②消毒的过程中若出现漏气现象，可调节消毒器盖内的胶垫的位置。
③灭菌完毕，不要急于取出消毒品，可利用消毒器的余热去除物品部分湿气，待半小时左右再移入干燥箱烘干。
这种消毒方法主要用于玻璃器皿消毒，一般温度在160℃维持90—120分钟就可以杀死芽胞，达到消灭包括细菌、芽孢在内的一切微生物的目的，还可破坏热原质。消毒完毕，待烘箱内温度冷却后再开门，避免因冷空气突然进入，烘箱内温度骤降引起玻璃器皿损坏。
紫外线直接照射消毒是各实验室常用的方法，主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。进行室内消毒时，紫外线灯应距地面2．5米，使各处有0．06微瓦能量的照射。当室内有尘土时，杀菌能力减弱，故其消毒环境应清洁无尘，并要求消毒空气湿度小于50％，才能达到杀菌效果。紫外线消毒时产生臭氧，对身体有害，故紫外线消毒停止后30分钟才可入室工作。目前有的实验室采用电子灭菌灯代替紫外灯进行空气消毒。
大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。常用的除菌滤器有正压式和负压式两种。
◇正压式(加压式)滤过消毒。
正压式除菌滤器为金属结构，中间垫一种特制的混合纤维素酯微孔滤膜，其过滤速度较快，效果较好，被多数实验室采用。滤膜孔径有0．6微米、0．45微米、0．22微米三种规格。滤过除菌时，常使用0．22微米孔径的滤膜。滤器上下层各有一槽，放置硅胶垫圈，将滤膜压紧固定。
滤膜使用时应注意：
①滤膜薄且光滑，容易移动，安装时膜位置一定要放正。过分干燥的滤膜很脆，在高压或高温干燥时易破裂，因此安装前可先用三蒸水润湿滤膜。
②为保证过滤效果，在使用时，每次垫两张滤膜，上面一张孔径为0．45微米，下面一张孔径为0．22微米，或两张均为0．22微米。
③使用无齿玻片镊子夹取滤膜，以防止镊齿弄破滤膜。
④加大压力时用力应均匀，用后打开滤器对光检查滤膜是否移动和有无破裂。
⑤滤器湿热消毒，37℃干燥。滤膜用后丢弃。若过滤少量液体，可将小型针头滤器安装在注射器上使用。目前许多厂家有一次性针头滤器出售。国产针头滤器易污染。
⑥不同厂家的滤膜质量有差异。
◇负压式滤过消毒
负压式滤过消毒常使用玻璃滤器。玻璃滤器以烧结玻璃滤板固定在一玻璃漏斗上做成，适于各种培养液的滤过除菌，但不宜滤过血清等粘稠液体，因为容易堵塞滤板孔。根据滤板孔径大小分为G0—G6几种规格，一般使用G6型(孔径为0．22微米)除菌。玻璃滤器漏斗接抽滤瓶，胶管连接抽滤瓶和抽气瓶，抽气瓶再与真空抽气泵相连，或 抽滤瓶用胶管与玻璃水泵相连。负压式滤过消毒的缺点是滤速较慢，清洗过程繁琐。
负压式除菌滤器安装使用注意事项：
①漏斗与抽滤瓶连接部位要旋紧，并用消毒布包紧连接部位，以保证瓶口不漏气。
②当抽滤瓶内有负压形成时，先夹紧抽滤瓶下口与抽气瓶连接的胶管，再缓慢停止抽气，防止有菌空气倒回，污染滤液。自然滤过一段时间，待流速减慢可再行抽气。
③当漏斗中剩余液体为50～100毫升时，夹紧下口胶管停止抽气，空气随液体自然滤过消毒进入瓶内，瓶内压力升高，真空解除。
④拆除真空泵和抽气瓶连接装置，拆除漏斗与抽滤瓶连接部包布。
⑤漏斗与抽滤瓶连接部位在火焰前方均匀烧灼后，两者分开，抽滤瓶斜放在超净台上，瓶口顺风向。
75％酒精、新洁尔灭、过氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒剂。0．5％的过氧乙酸在10分钟内可将芽孢菌和各种病毒杀死；乳酸蒸汽常用做无菌室内或周围环境的定期消毒；75％酒精常用于超净台的台面、器械、实验操作者的皮肤等的消毒，0．1％新洁尔灭用于对桌、椅、地面、皮肤、操作台面进行擦拭或浸泡消毒；0．1％洗必泰水溶液用于皮肤浸泡消毒。
塑料器皿不耐高温，清洗干净后用75％酒精(分析纯)浸泡过夜，灭菌三蒸水浸泡两次，每次10分钟，紫外线照射1小时，再经细胞基础营养液浸泡过渡后，供短期内使用。
大包装塑料器皿或不能用上述方法消毒的试剂，可用电离辐射消毒。电离辐射消毒方式有两种：一种是用2．5百万拉德60Co产生的γ射线照射48～72小时；另一种是用大于5百万电子伏特的高能电子束照射。前者穿透能力强，处理效果可靠，后者适于较小物品的灭菌。消毒时由辐照中心专业人员操作。
四.细胞培养用液的配制与除菌
动物细胞培养常用液有平衡盐溶液、培养基(天然和合成)及消化液等。配制这些常用液有严格的要求：
·使用高纯化的三蒸水。
·按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中。
·保证各组分完全溶解。
·进行pH值测试和调整。
·消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。
体外培养的细胞对水的质量十分敏感，普通自来水含有大量离子和杂质，对细胞生长不利，甚至会引起细胞死亡。因此，培养细胞所用的水必须高度纯化。目前纯化水有离子交换水和蒸馏水，前者由于仍带有非离子物质和有机物质，不适合组织培养使用。细胞组织培养必须使用三蒸水。经金属蒸馏器制备的蒸馏水又常混有金属离子，故还需经双重纯水蒸馏器(玻璃)蒸馏。本实验室组织培养用水制备过程是：自来水→离子交换水→玻璃双重纯水蒸馏器蒸馏两次。新鲜三蒸水应贮存于棕色磨口试剂瓶中，避免光对蒸馏水的作用。在使用过程中，应尽量减少瓶口开放次数，减少污染机会。蒸馏水存放时间不要超过两周，最好现制现用。
(2)平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)的配制
BSS是在Rringer生理盐水基础上发展起来的。它是人工合成培养基的基础用液，又常用来洗涤组织细胞。其主要成分是无机盐和葡萄糖。无机离子是细胞的重要成分，维持细胞渗透压及其生存环境的稳定；葡萄糖供给细胞生存所需的能量。BSS液中少量酚红是作为溶液酸碱度变化的指示剂，溶液变酸时呈黄色，溶液弱碱性(pH7．2—7．4)时呈深红色，pH值升高到7．6以上时为紫红色。在碳酸盐缓冲系统中，NaHCO3具有调节CO2浓度的作用。
Hanks液和Earle液是多数培养基的基础溶液，两者的主要区别是缓冲能力不同。Hanks液的NaHCO3含量较低(0．35克/升)，其缓冲能力较弱，一般用空气平衡，即利用空气中的CO2使溶液pH值平衡。
Earle含有高浓度的NaHCO3(2．2克/升)，其缓冲能力较强，溶液pH值需在5％的CO2培养箱中才能达到平衡。
1.BSS液的配制方法(以Hanks液为例)
甲液：Na2HPO4·2H2O 0．06克
KH2PO4 0．06克
MgSO4·7H2O 0．20克
葡萄糖 1．00克
NaCl 8．00克
三蒸水 750毫升
乙液：CaCl2 0．14克
三蒸水 100毫升
①将乙液徐徐加入甲液中。②将0．35克NaHCO3溶解在37℃ 100毫升三蒸水中。③用数滴NaHCO3液溶解0．02克酚红。④将②、③液移入①液中。⑤用三蒸水定容至1000毫升，充分混匀，4℃冰箱过夜。⑥滤过消毒，小瓶分装，冷藏。
注意：酚红对细胞有一定毒性，目前实验中的用量除0．02克外，还有0．01克和0．005克，也有BSS液中不加酚红的。酚红量不同，BSS颜色也不同。
2.配制BSS液的要求
①BSS液中各试剂规格为一级GR试剂或二级AR试剂。
②配制后液体呈桃红色，pH 7．4左右，没有混浊和沉淀。
③含钙离子、镁离子的物质要单独溶解。
④可配制10倍浓度的贮存液，滤过消毒，分装，每瓶10毫升，冰箱保存。使用时每瓶加三蒸水至100毫升。
⑤钙离子、镁离子是细胞膜的重要组分，有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无钙离子、镁离子离子的D－Hanks液或PBS液配制。
天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白、胶原和组织提取液。
◇血清
血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等，其中以胎牛血清质量最好，但来源困难，价格较贵。血清中含有：①多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白、酶等)和核酸；②多种金属离子(K＋、Na＋、Mg2＋、Cu2＋、Ca2＋等)；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白(fibronectin，FN)．、冷析球蛋白(cold insoluble globulin，CIG)等。血清为细胞提供激素；生长因子、转移蛋白、基膜成分等，但血清成分个体差异大，常影响实验结果，其来源又受限制。此外，血清也是污染细胞的一个途径，它还是分离细胞代谢产物的一种障碍。
优质血清透明，呈淡黄色，不溶血或少溶血。血清经56℃30分钟灭活后，颜色较深。血清灭活后可能丢失某些成分，但灭活血清性质相对稳定，便于使用和保存。细胞培养用的血清必须保证无细菌、支原体、病毒污染。血清总蛋白量在35—45克/升，球蛋白量不高于20克/升。球蛋白含量高，示胎牛或孕牛感染，因此，球蛋白含量越低的血清，其质量越好。
血清灭活处理步骤
①选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。
②对照瓶内放入与血清等体积的水。
③温度预试：对照瓶内插入2—3支经挑选的温度计(保证测试温度的准确性)，放入水浴箱中，接通电源，调节温度控制钮，使温度计所示温度保持在56℃。
④血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
⑤大瓶血清灭活后，进行分装。
⑥分装后，抽样做无菌试验，－20～－70℃保存。
使用血清注意事项
①实验者买到冰冻血清时，首先要观察血清融化后的颜色和清亮度，若颜色偏红，或色浅，或出现沉淀，表示血清质差或变质，应当退货。
②血清冻融后的最上层无色透明，活力最差，分装前应将其摇匀。
③血清反复冻融使用，其效价下降又容易污染。
④长时间冻存的血清，一旦冻融后出现沉淀物(此物抑制细胞生长)，应弃去。
⑤若有条件，先购买少量几种批号血清，进行细胞生长曲线、细胞克隆率检查，从而筛选出质量好的血清。
⑥为了使整个试验结果稳定，以便前后比较，应使用同一批号血清。
