微缩化技术在宏基因组测序建库中的应用
2020年伊始，突如其来的新冠疫情牵动着每个人的心。自武汉卫健委首发肺炎疫情情况通报后的短短一个星期，新型冠状病毒就在实验室中被检出，并获得了该病毒的全基因组序列。如此快速地确定病原体抢占研究先机，宏基因组测序技术功不可没。
宏基因组学(Metagenomics)，以环境样品中的微生物群体为研究对象，无需纯化培养，能够直接研究自然状态下的微生物群落。通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略可以快速获得微生物基因序列、多样性、种群结构、进化关系、功能活性等信息。
图片来源：Fields, Science. 2001, 291, 5507: 1221-1224
随着基因测序技术的迅猛发展，基于二代测序的宏基因组学能够帮助研究人员快速准确的得到大量微生物基因组数据和信息，宏基因组学研究已从分析少量样品迅速发展为对大规模样品的分析。那么随之而来的，可能就是经费的限制问题了。很多实验室已经通过实验体系微缩化的方法，来节约试剂和input成本。来自加州大学圣地亚哥分校的研究人员，使用SPT
Labtech的自动化液体处理平台mosquito进行宏基因组测序文库构建，在KAPA
HyperPlus试剂盒标准反应体系缩小了1/10的条件下，依然可以得到高质量的组装结果。对于多样性较高的宏基因组样本，依然保证了其基因组的复杂性。
10倍微缩化Kapa HyperPlus文库构建策略
微生物高通量测序：mosquito genomics“微”你而来
在微生物高通量测序领域，对于一些珍贵的微生物含量稀少的样本，如何精准移液一直是科学家们想要解决的问题，现在小于0.5μL的移液量，普通移液枪已经很难完成精确操作了。SPT
Labtech公司（前身为TTP
Labtech）的mosquito是全球最受欢迎的纳升级移液工作站之一，它拥有独有的固相置换技术，可以无视任何黏度的试剂或DNA，可对500nL-5μL
(HV设备)或25nL to 1.2μL (LV设备)样品进行精确加样。
在微生物扩增子测序及宏基因组测序中，使用mosquito进行文库构建可以节省大约1/10的建库试剂成本。不论是源板还是枪头的死体积极低，不会造成试剂额外的浪费，一次性枪头自动替换，有效避免样本的交叉污染，灵活、准确、高效的特性使它成为众多微生物基因组学研究实验室所钟爱的设备。
1、马里兰大学医学院微生物组服务实验室是如何实现降低16S 测序试剂成本并提高产量的?
mosquito的使用非常灵活，能与多种自动化设备进行整合。在马里兰大学医学院基因组学研究所微生物组学服务实验室的NGS实验流程中，通过整合mosquito以及其他大型高通量设备，实现了整个流程的自动化。
微生物扩增子测序文库构建微缩化流程
“我们中心的核心工作就是做微生物测序，处理各种各样与疾病或者环境有关的微生物样本，
mosquito和我们实验流程很好的整合在一起，我们用它来进行文库制备，降低了样本用量，仪器不论是软件编程，还是使用起来都非常方便，以前我们在做测序的时候会浪费比较多的试剂，mosquito给我们带来的好处是，我们能用更少的材料去做实验，就可以拿到我们需要的结果，它速度很快，几分钟就能完成一快板，又快又省经费。”
——Mike Humphrys 马里兰大学微生物实验室主任
2、mosquito助力Cell杂志重磅研究：肠道菌群或是自闭症发病与治疗的关键环节！
来自加州理工学院的研究人员在Cell杂志上发表了题为Human Gut Microbiota from Autism Spectrum Disorder Promote Behavioral Symptoms in Mice的论文。发现肠道菌群可通过生成具有神经活性的代谢产物而调控小鼠的行为，本研究选取自闭症患者和正常个体的肠道菌群移植入无菌小鼠肠道中，对本体及其后代小鼠的行为学特征及组织样本进行分析。携带有自闭症患者肠道菌群的小鼠(ASD小鼠)表现出明显的类自闭症症状。
为鉴别影响小鼠自闭症行为的关键菌种，研究者对自闭症患者的肠道菌群、移植小鼠及其后代的肠道菌群类别进行了系统分析，该研究中，使用mosquito进行了10倍微缩化的宏基因测序文库构建工作。研究发现自闭症患者及ASD小鼠的肠道菌群与对照组有明显差异。其中，正常个体/小鼠中卵形拟杆菌(Bacteroides
ovatus)和粪副拟杆菌(Parabacteroides
merdae)有明显富集；而自闭症个体/小鼠中毛螺菌科的菌种(Lachnospiraceae)则明显多于对照组。提示了特定类型的肠道菌群或是引起自闭症相关症状的重要环节。
肠道菌群移植小鼠模型中有明显差异的菌种
3、病原微生物检测：mosquito搞定18倍微缩化NGS文库定量！
在Microbiome杂志发表的一项名为Detecting eukaryotic microbiota with single-cell sensitivity in human tissue的研究中，来自剑桥大学的研究人员对先兆子痫妊娠结局不良人群（n = 199）和健康对照人群（n = 99）的胎盘细胞进行改进的18S扩增子测序，使其能够在超过70,000个人细胞中检测到恶性疟原虫，酿酒酵母或弓形虫的等病原微生物单个基因组拷贝。其中使用了mosquito对18S扩增子文库进行质检，并把Biotium AccuClear dsDNA quantitation试剂盒体系缩小了18倍。使用这种方法，研究院人员无法在胎盘活检中检测到真核病原体生物。说明胎盘的真核感染不是上述妊娠并发症的根本原因。这种病原微生物的检测方法也为感染性疾病的临床诊断提供了方法参考。
结束语
就在近日，宏基因组测序再度在疾病研究中发挥作用。3月4日，北京地坛医院对新冠肺炎患者采集的脑脊液标本进行宏基因组二代测序、鉴定可能的感染病原体过程中，获得了SARS-CoV-2病毒基因组序列，首次证实病毒攻击中枢神经系统的病例。
宏基因组测序是微生物领域研究的强有力工具。mosquito用无与伦比的性能和通用性，为基因组学研究实验室提供低成本、高效率的NGS建库方案。
参考文献：
Sanders, J. G. et al. Optimizing sequencing protocols for leaderboard metagenomics by combining long and short reads. Genome Biol. 20, 1–14 (2019)
Sharon, G.; Cruz, N.J.; Kang, D.W.; et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell 2019, 177, 1600–1618.
Susanne, Lager, Marcus, et al. Detecting eukaryotic microbiota with single-cell sensitivity in human tissue.[J]. Microbiome, 2018.
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