液质联用技术在药物体内代谢研究中的应用
色谱分离模式多，适用范围广，是解决复杂体系中混合物分离分析的高效手段。但色谱对化合物的定性常常需要借助于标准品的对照才能进行保留值的定性和定量，因此色谱和各种光谱手段的联用技术一直是研究重点。液相色谱质谱联用是20世纪70年代发展起来的分析技术。高效液相色谱是以液体溶剂作为流动相的色谱技术,一般在室温下操作,可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等),分析范围广,而且不需衍生化步骤。据统计,在已知化合物中有70% 是不挥发性的,所以在生命科学、医药领域等方面有广阔的应用潜力。质谱是强有力的结构解析工具,能为结构定性提供较多的信息,是理想的色谱检测器,不仅特异,而且具有极高的检测灵敏度。液质联用技术将液相色谱分离技术与质谱检测手段相结合，集液相色谱(LC)的高分离能力和质谱(MS)的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体，已成为体内药物代谢研究中不可替代的一种强有力的分离分析工具。
药物代谢是指药物进入体内后经体液、酶等的作用，进行氧化、还原、水解、结合等一系列生物化学反应的过程。药物代谢的研究,包括药物及其在各种复杂的样品基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。利用液质联用技术,不仅可以避免复杂繁琐的分离纯化代谢物样品的工作,而且能分离鉴定以往难于辩识的痕量药物代谢物,从而迅速方便地解决问题。因此,在探讨药物代谢特征、确定药物代谢物结构及代谢途径与药物及代谢物的药理作用及毒副作用间的关系,即结构代谢活性/毒性三者之间的相关性等药物代谢研究方面,液质联用技术已被开发并显示出广阔的应用前景。
1 LCMS的接口技术简介
LCMS技术的关键在于解决高流量的液相色谱系统和高真空的质谱仪器之间的矛盾，如果液相色谱的流动相直接进入质谱的高真空区，则每分钟增加的气体量为几百升，这将严重破坏质谱系统的真空。为解决这个问题，必须通过接口。接口起到下列作用：将流动相及样品气化;分离除去大量的流动相分子;常需完成对样品分子的电离。LCMS在20多年的进程中前后引入了20多种不同的接口技术，当前人们广泛采用的接口技术有: 热喷雾(TSP)、等离子体喷雾(PSP)、粒子束(LINC)、大气压化学电离(API)和动态快原子轰击(FAB)。表1中比较了液质的各种联用技术，成功的解决了液相色谱与质谱联用的接口问题，使液相色谱质谱联用逐渐发展成为成熟的技术。
其中API是一种在大气压下将溶液中的分子或离子转变成气相中离子的接口，是一种常压电离技术,不需要真空,减少了许多设备,使用方便,因而在近年来得到了迅速发展。它包括电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)和大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)两种方式，都是非常温和的离子化技术，其区别主要在于大气压下产生气相离子的方式不同。ESI是目前为止“最软”的电离技术，在常压下使样品溶液通过雾化气等辅助手段的帮助，产生高度带电荷的雾状液滴，沿着压力梯度进行迁移，在此过程中液滴由于溶剂蒸发或库仑爆炸而体积逐渐减小，最后产生完全脱溶剂的离子。基于以上作用原理，ESI多用于极性、不挥发性、质量数较大、热不稳定的化合物，尤其适用于生物分子聚合物的分析。
而在APCI接口中，样品溶液由具有雾化气套管的毛细管端流出，被氮气流雾化，通过加热管时被气化，在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离形成溶剂离子，之后这些溶剂离子和雾化气与气态的样品分子反应，得到样品分子的准分子离子。由于要求样品分子气化，因而大气压化学电离的对象为极性较弱的小分子化合物。
2 药物体内代谢产物的样品的获得和预处理技术
代谢产物可以在给药后由血、尿、粪便等体液及排泄物中获得，或用含药物的营养液灌流离体脏器与组织切片，以及药液与肝微粒体酶等药物代谢酶温孵获得。药酶温孵法可以获得较大量的代谢物，但花费较大。药物离体脏器灌流与组织切片法中的灌流液含内源性物质很少，较易分离制取代谢产物。自血、尿中获得代谢产物方法较简单，但所得样品的量较少。
体内药物分析的样品成分复杂，对分析测定干扰严重，因此，样品的预处理是做好体内药物代谢研究的重要前提。液液萃取(LLE)和沉淀蛋白质是目前常用的方法。液液萃取常用的溶剂有氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等。对于弱酸和弱碱性药物及其体内代谢物，通常需要加入缓冲液调节样品的酸碱性，使药物及其代谢物成为游离的酸或碱，以便能为溶剂所萃取。而沉淀蛋白质法操作非常简便，对于水溶性较大的药物及其代谢物尤为重要。沉淀剂可以是某些阳离子、阴离子、中性盐及有机溶剂。
固相萃取(solidphase extraction, SPE)是近10年迅速发展起来的一种样品预处理技术，它是以液相色谱分离机理为基础，建立起来的分离与纯化以及富集的方法。SPE处理样品有许多引人注目的优点：首先是其安全性，可以避免使用毒性较强或易燃的溶剂;其次是不会发生LLE中经常出现的乳化问题，萃取回收率高，重现性好;第三，SPE操作简便、快速，可同时进行批量样品的预处理。基于上述优点，SPE在体内药物及其代谢物的分析中应用极其广泛。
3 在各类药物及其代谢产物分析中的具体应用LCMS在药物代谢研究中除了可确定分子量之外，还可以根据特异性断裂规律推导出重要部分结构甚至是完整的结构。其根据是由于多数药物的代谢物保留了原形药物分子的骨架结构，因此，代谢物可能与母体药物具有相似的裂解规律，即失去一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，利用LCMS可以迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。
3.1 中药
中药成分复杂，各组分之间的结构往往非常相似，且其在体内常发生代谢变化或复杂的相互作用，使中药代谢研究更加困难。LCMS的联用技术可先采用色谱将中药的有效成分加以分离，再用质谱对其相关成分进行在线分析检测，给出丰富的化合物结构信息，且由于其选择性强、碎片离子重现性好，对推测未知代谢物结构有重要意义。采用液相色谱电喷雾离子阱色谱(LCESIITMSn)法研究了氧化苦参碱在大鼠体内的主要代谢物，在实验中采用给药后大鼠的尿样作为待测样品，经SPE法进行样品预处理后待用。采用的具体色谱条件为：Aichrom ReliAsil C18不锈钢色谱柱(150mm×2mm,5μm)，甲醇0.01%三乙胺水溶液流动相(60:40),0.2 mL/min 流速，室温洗脱，进样量20μL。之后经ESI离子源离子化后，采用全扫描一级质谱(Full scan)及其源内碰撞诱导解离(SCID)、全扫描二级质谱(Full scan MS2)及三级质谱(Full scan MS3)等方式进行测定。经研究发现大鼠尿样中有原药及其6种Ⅰ相氧化还原代谢产物，主要代谢物为苦参碱，未发现Ⅱ相代谢物。用HPLCMS法研究了左旋黄皮酰胺在Beagle犬血浆中的药代动力学过程，结果显示该药物的代谢符合二室模型，代谢物的血药浓度经时过程与原药相似但血药浓度相对较低。王亚丽[7]等以LCMS法对当归活性成分进行了研究，用甲醇水梯度洗脱系统，在APCI的模式下，对兔血清中数种成分同时定性，结果发现，当归口服液给药后，在兔血清中可测得阿魏酸、藁本内酯、发卡二醇等多种成分。
3.2 抗菌药物
采用LCMS法考察了罗红霉素在犬体内的代谢转化及口服和静脉注射给药途径对药物代谢的影响，共检测到13种罗红霉素代谢物，包括N去甲基和N,N双去甲基衍生物、肟醚侧链O去烷醚基衍生物、脱红霉糖衍生物、罗红霉素及其代谢物的Z式几何异构体衍生物，结果表明罗红霉素在犬体内主要经历4种代谢途径，罗红霉素及其代谢物的几何异构与脱红霉糖代谢在口服和注射两种给药途径间存在显著的差异。采用LCMS技术测定了患者服用环孢素后全血中环孢素及其代谢产物浓度，研究了环孢素的体内代谢规律：环孢素与其3种代谢产物去甲环孢素、羟化环孢素及二羟化环孢素的相关性逐渐递增，羟化环孢素的浓度与二羟化环孢素的浓度具有较强的相关性，表明测定环孢素及其3种代谢物不仅是延长移植器官在体生存期、避免肝肾性综合体征反应的一种有效方法，而且对于个体化用药具有重要意义。
4 结语
综上所述，LCMS能够在对生物样品进行适当预处理的基础上，不需获得很好的色谱分离效果即可筛选检测其中的微量组分。同时，LCMS技术的应用能减少分析方法建立以及样品处理分析所用的时间，并且允许同时对多个成分进行定性、定量分析，在分析大量生物样品时有很高的选择性。由此可见，随着LCMS联用技术的不断进展，它在药物代谢研究中的作用将越来越大，必将成为首选工具之一。
