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代谢组学研究的影响因素与降低生物化学和化学...（一）

2020.5.18

代谢组学研究的影响因素与降低生物化学和化学噪音的策略

目的

为代谢组学生物标记物的发现开发一套全新的自动化工作流程和仪器分析方法。

前言

在制药行业中，代谢组学用于研究潜在候选药物的药理学响应所产生的生化变化，其识别毒性 / 药效标记物的能力可以显著加速药物研发的进程并帮助制定合适的临床计划。来自于液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS）的代谢轮廓实验数据，包含大量的化学噪音，常常干扰生物标记物的发现。本文采用全新的质谱技术和数据处理软件来降低动物实验中的化学背景，进而研究药物诱导的变化与动物年龄和营养的关系。

常规 LC-MS 代谢组学研究存在很多冗余的（一种组分有多个离子）和不相关的（化学噪音）数据。同时影响代谢轮廓的外部因素（年龄、营养）增加了生物多变性。由于许多化学物质是未知的，因此，在进行结构鉴定前过滤掉假阳性结果尤为重要。超高分辨率仪器结合超高效液相色谱（UHPLC）的分离可以提供足够的分辨率将代谢物与化学背景区分开，解决了化学噪音和数据冗余的问题。准确质量数能确保识别相关信号所需要的精细数据处理。此技术可大大减少数据量，并改进目标代谢物的定量。生物因素对代谢轮廓有着深远的影响，即使细小的代谢变化也会掩盖药物诱导的代谢效应。了解大鼠的正常代谢变化能使“生物噪音”降到最低，并提供更为可靠的药物相关的代谢变化信息。

实验部分

样品前处理

抽取各组雄性大鼠（饱食，急慢性禁食，不同年龄）的血液样品并进行 LC-MS 分析。取 50 µL 血清样品，加入 100 µL 含 0.1% 甲酸的冷甲醇溶液以除去蛋白质。干燥样品，加入 200 µL10%甲醇水溶液复溶。每份样品中加入N-苯甲酰基-D5甘氨酸（tR = 4.27 min， m/z 185.0969）作为内标。

液相色谱

采用Thermo ScientificTM Open AccelaTM 1250 UHPLC 系统和 Thermo ScientificTM Hypersil GOLDTM aQ 色谱柱（150 × 2.1 mm, 1.9 µm粒径）进行色谱分离。进样量为3 µL。色谱条件如下：

质谱

采用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Focus Hybrid QuadrupoleOrbitrap 质谱仪（图 1）分别在正离子和负离子模式下采集得到高分辨率准确质量数（HRAM）数据，分辨率为 70,000（FWHM）。

数据处理

采用Thermo ScientificTM SIEVETM 软件的组分提取（Component Extraction, CE）数据处理算法分析数据，测定大鼠禁食产生的代谢效应。

结果与讨论

图 2 显示了N- 苯甲酰基-D5- 甘氨酸内标物的高质量 LC-MS 数据。在质量轴校准后的25 到 35 小时之间采集血清 QC 重复样的正离子模式数据，展示了 UHPLC 分析时间内优异的峰面积和质量数测定的稳定性。基线处的色谱峰宽为 3.6 s，每个峰获得了 15 次扫描。图 3 显示了测定内源代谢物的元素组成时分辨率为 70,000 的重要性。A+2 同位素（ m/z 313）附近的展开图中显示存在一个 34S，这在 35,000 分辨率下（模拟）是不可能发现的，因为分辨率较低时，13C2 同位素与 34S 是不能分辨的。