EMSA凝胶迁移（二）
实验步骤
生物素标记探针:
1. 按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩
超纯水 25μl
5×TdT Reaction Buffer 10μl
探针(1μM) 5μl
Biotin-N4-CTP 5μl
TdT (2U/μl) 5μl
37℃反应30分钟
2. 加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应；
3. 加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g离心2min，保留上层水相，－20℃保存；
4. 结合反应前等体积混合两条标记引物，90℃退火引物，并自然冷却至4℃，待用。
抽提核蛋白：
1. 2~3×106密度铺60mm细胞培养板，培养约12h；
2. 移去细胞培养基，PBS洗细胞一次；
3. 加入1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于1.5mL离心管；
4. 1000g 离心2min，吸去上清；
5. 加入160μl Buffer A，重悬沉淀，冰育20min；
6. 加入含2.5％NP-40的Buffer A，涡漩10s，4℃ 15000g 离心5min；
7. 吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃涡漩25min，4℃ 18000g 离心5min；
8. 吸取2μl上清采用Bradford法测蛋白质浓度，其余储存于-80℃。
配置非变性聚丙烯酰胺凝胶(以6％浓度为例)
5×TBE 1mL
30％Ac-Bi 2mL
40％Glycerin（甘油） 625μL
DDW （双蒸水） 6.125mL
10%AP 150μL
10%TEMED 100μL
以预冷为4℃的0.5×TBE为电泳缓冲液，100V预电泳30-60min（时间不定，跑到溴酚蓝占整块胶的三分之二处）
EMSA（参考PIERCE公司试剂盒）
1. 特异性的证明
使用的探针序列需证明其是否与目的蛋白特异性结合，确定目的条带的位置。
按照“步骤"中的体系，做以下四组平行结合实验：
（在加入ddw，10×binding buffer，Poly(dI.dC)的基础上)
1) 生物素标记的探针
2) 蛋白质粗提物
3) 蛋白质粗提物＋200倍浓度的非标记的同种探针（即冷探针）
4) 蛋白质粗提物＋200倍浓度的非标记的突变探针（可以设计多种突变类型的探针，看是否能竞争结合）
5) 蛋白质粗提物＋抗体
室温反应10min，然后加入生物素标记的探针；
室温继续反应20min，做EMSA检测。
结果分析，如果出现如下实验结果
1) 显示游离探针位置
2) 显示游离探针位置和迁移带位置
3) 只有游离带，没有迁移带
4) 和2)带型一致
则证明探针与目的蛋白为特异性结合。
步骤：
1. 按如下顺序加入反应物，温和混匀（20μl体系）
ddw ――
10×binding buffer 2μl
Poly(dI.dC) 1μl （以上文字已说明由公司定）
核蛋白粗提物 4－10μg（温和混匀）
生物素标记的探针 0.5μl
室温反应20min，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上样10－20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
2. 电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE至少10min
以预冷的0.5×TBE为电转缓冲液100V转胶于尼龙膜上，45min。
3. UV BOX下，以贴近膜一面面向紫外光源，以254nm激发光交联15min（紫外交联仪1200能量，照2次）
4. 加入25mLBlocking Buffer，以约70rpm在脱色摇床上封闭30min
5. 将SA-HRP以1:30000-50000稀释于12mL Blocking Buffer，脱色摇床70rpm作用20min
(洗膜过程全部在脱色摇床上进行, 约100-140prm)
6. Buffer II 25ml, 5min
7. wash buffer 25ml 15min
8. Buffer III 25ml 5min×2次
9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12. 将膜于滤纸稍适吸干，加入到以1:20稀释的发光反应液(宁波奥唯)，作用1-5 min，将尼龙膜封于保鲜膜中（避免褶皱和气泡的产生），暗室曝光1-5min，检测信号。
注意事项
使用此protocol效果图
图1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF细胞，分别刺激0、15、30、60、120min，检测NF-?B的量。（p：probe only. 只加入标记探针未加入核蛋白抽提物）
