凝胶迁移实验（EMSA）之三：实验步骤
实验材料：DNA样品
试剂、试剂盒：
[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE
buffer、重蒸水、甲叉双、丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝
仪器、耗材： 水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽
实验步骤：
一、探针的标记
1. 如下设置探针标记的反应体系：
（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
（3）Nuclease-Free Water ：5微升。
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。
（6）总体积 10微升
（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
2. 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
3. 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
二、 探针的纯化
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：
1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
3. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
4. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
三、EMSA 胶的配制
1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
2. 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。
重蒸水 16.2毫升。
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。
（3）80% 甘油： 625微升。
（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。
（5）TEMED ：10微升
3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
四、EMSA结合反应
1. 如下设置EMSA结合反应
阴性对照反应：
(1）Nuclease-Free Water ：7微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。
（4）标记好的探针 ：1微升。
（5）总体积 ：10微升。
样品反应：
（1）Nuclease-Free Water ：5微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。
（4）标记好的探针： 1微升。
（5）总体积： 10微升。
探针冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。
（4）未标记的探针： 1微升。
（5）标记好的探针： 1微升。
（6）总体积 ：10微升。
突变探针的冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。
（4）未标记的突变探针： 1微升。
（5）标记好的探针： 1微升。
（6）体积 ：10微升
Super-shift反应：
（1）Nuclease-Free Water：4微升。
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
（4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。
（5）标记好的探针：1微升。
（6）总体积 ：10微升。
2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
3.
加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建
议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
五、 电泳分析
1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
4.
剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边
缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。
