使用悬浮或贴壁细胞系进行基因治疗的商业化生产
Alex Chatel 和 Jean-Christophe Drugmand
本文将探讨从实验室到临床的传统路径，以及scale-X 固定床技术如何提供一种替代解决方案，以满足商业化需求。
有报告依此预计，到2023年，基因治疗市场将达到30亿美元，复合年增长率 (CAGR)
达34%，这使其成为生物制药市场增长最快的领域之一。最初，基因治疗的普及是因为它能够治疗以前无法治愈的罕见疾病；然而，这些产品在治疗癌症等更常见的疾病方面正获得越来越多的关注。基因治疗中最常用的病毒载体是腺相关病毒
(AAV) 和慢病毒 (LV)，但是，腺病毒和逆转录病毒在这个领域也很受关注 (后者主要用于嵌合抗原受体T (CAR-T)
细胞治疗)，而此类病毒载体必须在细胞培养中产生。尽管也有报导开发稳定生产细胞系，但行业一般选择使用瞬时转染（transient
transfection）作为将病毒基因组整合到细胞中的手段。人胚肾293是最常见的宿主细胞；此外，昆虫细胞也较常使用。此类细胞源于组织，因此倾向于贴壁生长，但也可经驯化后在悬浮培养中生长。
基因治疗开发商在早期阶段的主要驱动力是快速进入临床，以证明产品的有效性，从而为工业化筹集更多的资金。与此同时，选择用于临床物料生产的平台必须是可放大的，以达到目标产能并优化成本效益。在开发的早期阶段，贴壁细胞系是最常见的选择，因其容易获得，在实验室规模条件下易于培养，且对生物工程专业知识的要求较低。
随着基因治疗产品进入临床以及生产规模的提高，开发商可能会考虑切换到悬浮细胞系，因为这种方式被认为具有可规模放大的优势，可以使用众所周知的搅拌罐生物反应器
(STR)
更为简单地实现工业化，而不是使用多层平面培养系统。为了减少前期支出并克服缺少生产经验所带来的挑战，开发商通常会选择与CDMO企业合作，后者可能会帮助选择细胞系，因为有些CDMO可提供ZL系统。促使开发商考虑悬浮细胞系的另一个驱动因素是，出于生物安全、成本、供应和工艺需求等方面的考虑，希望避免使用血清。然而，在工业生产中使用悬浮驯化的细胞也存在一些缺点，这将在后文进行讨论。最近的技术发展已经帮助开发了更为先进的固定床生物反应器 (FBR)，能够使用贴壁细胞系成功且经济高效地用于基因治疗产品的开发和商业化，相比基于悬浮培养的系统，其具有多方面的优势。
Scale-X生物反应器设计
从历史上看，搅拌罐生物反应器是从化工行业演变而来的，其开始是为了满足酿造业的需要，然后是生物制药行业，以获得可负担得起的生物药产品。搅拌罐生物反应器有几个优点：可规模放大，实现这一点的原理已众所周知；搅拌罐生物反应器可实现对培养条件精确、可重复的控制；且搅拌罐生物反应器可实现高度的自动化。20世纪80年代，治疗性单克隆抗体(mAb)
的兴起，推动了人们对中国仓鼠卵巢 (CHO
)细胞进行悬浮驯化、以便使用搅拌罐生物反应器进行工业化生产的需求。随后，持续数十年的开发工作进一步提高了该细胞系的稳健性，并将产物滴度提高了100倍，从而显著降低了生产成本。用于基因治疗的细胞还没有经过这个漫长的驯化过程，这意味着当前用于病毒载体生产的悬浮细胞系在工业化生产背景下仍然存在一定的稳定性问题，例如，搅拌罐生物反应器中存在的剪切力的影响以及对环境变化的敏感性(pH、DO、温度等)，且其需要瞬时转染步骤来将病毒物料引入细胞
(虽然存在用于病毒载体的稳定生产细胞，但有多方面的缺陷)。对于搅拌罐生物反应器，已经有良好建立的规模放大策略，且从毫升规模到6,000升都有一次性使用的选择。
最近的技术创新提供了替代性解决方案。突破性的固定床生物反应器的发展为快速开发和放大作为搅拌罐生物反应器替代选择的贴壁平台带来了新的机遇。固定床生物反应器为细胞贴壁提供了支持基质，同时可实现与搅拌罐生物反应器相同水平的控制、直接的规模放大策略以及工业化生产能力。与搅拌罐生物反应器相比，固定床生物反应器是 “分离的” 系统，细胞固定在”床”上，与液体介质解耦，这可允许在对参数进行优化的同时，减少对细胞的直接影响、比如剪切力等。尽管是一项相对较新的技术，固定床技术已经在基因治疗领域获得了相当大的吸引力，因为它为工业化提供了快速解决方案，降低了工艺开发风险，同时确保稳健的规模放大策略以及使用一次性使用技术进行工业化批量生产的能力。固定床生物反应器将细胞“捕获”在一个固体但可渗透的结构内，培养基循环通过该结构，从而确保足够的营养物和氧气分布。相比搅拌罐生物反应器，固定床的原理可允许细胞生长至更高的单位罐体积细胞密度，从而实现更紧凑的设备设计以及更低的足迹，同时获得与搅拌罐生物反应器相当的生产力。固定床生物反应器的罐体积范围为数百毫升到约50升，后者产能相当于1,000升的搅拌罐生物反应器，甚至更高。
生物工艺考量
为了促进细胞生长，整个生物反应器中的营养物质和氧气供应必须是均匀的。在悬浮培养中,这点通过培养基中营养物的供应(例批次、补料分批或灌流模式)、小规模生物反应器中顶部气体循环或大规模生物反应器中的鼓泡带入氧气、以及确保均匀混合的搅拌来实现，同时需确保气体传质
(kLa)
充分，且没有温度和pH的梯度变化。但如果各个参数没有得到充分的控制，将形成对细胞健康有害的环境。搅拌桨的机械剪切力以及大量分散的气泡所引起的氧化应激也可能对细胞有害。小规模反应器中的混合会比大规模反应器中的混合效率更高，这意味着在工艺开发阶段，在不妨碍细胞生长的条件下，更容易获得令人满意的气体传质。
规模放大时，罐总体积( m3) 与可用于热及气体传质的面积 (m²) 的比值会提高，这意味着搅拌和气体流速必须非线性地增加，以保证足够的气体传质 (O2摄入、CO2脱气)，并避免非均质的风险(营养物、pH、气体)。由于细胞悬浮在液体培养基中，会暴露于更高的机械应力以及局部氧化应激的风险，可能导致生长和生产下降。
在固定床生物反应器中，营养物质和气体通过固定床结构内培养基的循环或灌流而提供给细胞，同时细胞被固定。细胞只在接种阶段可能与搅拌桨接触，这意味着它们暴露于高剪切力的几率有限。但病毒物料会在罐内自由循环，如果这些物料对剪切敏感，就需要格外小心。而使用结构化固定床可促进均匀的细胞分布，并可在较低的搅拌速度下进行操作，从而降低剪切力暴露。固定床生物反应器的罐体积比同等产能的搅拌罐生物反应器小得多，因此，进行规模放大或缩小时，罐体积与用于气体及热交换的面积的比值不会发生太大变化，更容易保持罐内的均匀状态。
规模放大策略
以快速、无风险且经济的方式将细胞培养工艺从实验室规模放大到商业化规模是新型基因治疗开发商所面临的挑战。理想情况下，在小规模条件下建立的工艺步骤和条件必须可以线性地转化为大规模工艺，而不需要在大规模条件下进行再开发，因该过程将非常昂贵，且会导致产品上市的延迟。
对于使用搅拌罐生物反应器的悬浮细胞，种子扩增相对简单：在摇瓶中制备接种液，然后逐渐增加体积至生物反应器，通常一次增加达10倍，直到达到生产规模罐所需的接种量。在此期间，收获细胞，并用作下一个规模生物反应器的种子。对于使用固定床生物反应器的贴壁细胞，接种液的准备包括在培养皿中的初步细胞生长，然后是多层细胞培养瓶。细胞酶解脱落，以用于接种固定床生物反应器。需小心确保细胞以单个单元的形式存在，以促进细胞在整个固定床内的均匀分布，这对于确保工艺的可预测性和可再现性至关重要。
固定床生物反应器的一个优点是，由于罐体积较小，在接种时，细胞密度高于搅拌罐生物反应器，接种所需的细胞也相对较少，降低了生成种子的操作负担。在细胞扩增阶段，必须确保营养物质和气体在非限制条件下供应，如之前所提到的，在搅拌罐生物反应器中，如果不仔细控制，通常会产生剪切和氧化应激。灌流是维持细胞培养和达到高产量的普遍选择，但需要一定的开发工作。在搅拌罐生物反应器中，必须使用外部细胞截留装置，对此，有一些低剪切的装置选择，可将细胞应力最小化。而固定床生物反应器在这方面又另具优势，因为细胞被固定床”自然”截留，因此无需复杂的细胞截留装置。这既有利于细胞(较少暴露于剪切力条件)，也有利于降低工艺的复杂性和成本。
实验室规模的转染通常是在理想的条件下进行的，此时，可选择性地进行漂洗步骤，以将培养基去除并置换为转染混合液。这通常不容易在搅拌罐生物反应器中大规模地进行，因为这将需要处理数百到数千升的液体。相反，要么通过过滤将细胞进行浓缩，要么将混合液直接添加到细胞培养中。两种方法都有缺点：浓缩是一个额外的操作步骤，需要时间和工艺开发，而在不进行预漂洗步骤的条件下，以与工艺开发时不同的最终浓度加入转染混合液，必须进行工艺的重新开发，以确保转染效率。此外，转染混合液对pH值的变化敏感，因此，大规模反应罐中的不均匀性也是问题的来源。而在固定床生物反应器中，这又是另一个故事：只要罐体积和可用于生长的表面积之比保持相同，在小规模条件下开发的转染工艺就可直接且线性地转移到大规模培养中，而不需要浓缩、稀释或者重新开发转染混合液。
总结
虽然基于悬浮的细胞培养工艺已经被成功地用于生物药的放大生产，并获得了相当高的产物滴度以及相对较低的产品成本，但其在基因治疗产品生产中的应用受到搅拌罐生物反应器在基本机制和操作局限性等方面固有缺陷的妨碍，这会影响产量，并导致工艺复杂化。新兴的固定床生物反应器技术可实现贴壁细胞系经济高效的工业规模应用，其获得的可放大、可再现、且更为简化的工艺(例如缩短种子扩增链、有效的转染以及更低的工艺体积)将扮演越来越重要的角色，确保基因治疗产品生产能达到市场所需的足够的产量，并将其成本降低至可负担的水平。
