完美基因编辑: 新方法可消除CRISPR-Cas的脱靶效应
前段时间，麻省理工的研究人员发现基因编辑工具CRISPR-Cas系统具有脱靶效应。近日，这个研究小组的负责人张峰教授表示，他们已经找到了影响CRISPR-Cas系统精确度的关键因素，这一发现将使该系统在人类细胞中的应用更安全。目前，这一研究发表在Nature Biotechnology上。
借助这项研究，科学家可以一次性破坏多个基因，从而提高治愈人类基因缺陷疾病的几率。
脱靶效应
CRISPR-Cas RGN由DNA切割酶Cas9以及一条含20个核苷酸的RNA短链(作用是与目标DNA链匹配)组成。CRISPR-Cas RGN模拟的正是一些特定细菌的原始免疫系统。当这些微生物受病毒或其他生物感染时，它们会拷贝入侵者的一段遗传编码并整合至自己的DNA中，并遗传给下一代。当子代细菌再次遭遇这些入侵者时，细菌的Cas9在与所整合DNA匹配的RNA链的向导下，在入侵者DNA的目标位置进行切割，从而使病原体失活。
大约一年前，科学家首次报道了利用重编程的CRISPR-CAS RGN靶定并切割特定的DNA位点。该技术依靠短链RNA片段对目标DNA进行靶定，使其相比其他的基因编辑工具，如ZFN、TALEN等均简单易用，并且RGN经过改造后可同时在一个基因组中引入多个遗传改变。
但是，CRISPR-Cas RGN可导致额外而非需要的遗传改变的可能性则较少被研究过。因此美国麻省总医院的Joung博士的团队决定对CRISPR-Cas RGN在人类细胞中的脱靶现象进行研究。由于CRISPR-Cas RGN的指导RNA片段与目标DNA只依赖于20个核苷酸进行匹配，因而他们推测这段RNA有可能也会与目标外的其他片段发生结合。
尽管过往的研究表明，即便是一个核苷酸的错配都可以阻止CRISPR-Cas RGN继续发挥作用，但是麻省总医院的这项研究却发现，在人类细胞系中，多达5个核苷酸的错配都未必阻止目标位点外的切割。他们还发现，脱靶位点的突变率与目标位点的突变率相同甚至更高。
消除脱靶效应
为了寻找到最佳的基因组序列，研究小组成员Patrick Hsu and David Scott建立了一个计算机模型。“每一个基因都有成百上千的位点可以进行编辑。利用计算机模型，可以识别几乎任何一个基因。该模型可以帮助研究人员寻求最佳编辑位点。”麻省理工学院脑认知研究方向的助理教授张峰解释道。
在需要对目的基因的功能进行破坏，或者要进行目的基因替换时都可以使用CRISPR-Cas系统。科研人员如果要进行目的基因替换，就必须在目的基因被切除后，将新基因的模板复制到基因组中。
传统的建立转基因小鼠的方法是将小片段DNA整合到小鼠胚胎干细胞中，但是其耗时长，并且效率低。这项新技术为建立转基因小鼠提供了一个更快捷更有效的途径。
Broad研究所和麻省理工学院McGovern研究院的张教授介绍说，只需要三个星期，CRISPR-Cas系统可以同时将多个基因一次性编辑完成，其还可以被应用于在实验室中建立转基因细胞系。
自从张峰教授的研究团队在今年一月首次对 CRISPR-Cas系统进行阐述后，来自世界各地超过2000个实验室已经开始使用该系统建立转基因细胞系或者转基因动物。
研究人员发现有两种方式可以提高序列靶向特异性。第一种就是利用计算机模型。第二种方法就是调整导向RNA序列的量。在一般情况下，减小RNA序列的量可以减弱脱靶效应，但是不利于目的基因的裂解。对于每一个序列来说，高目标效应和低脱靶效应间存在一个最优的平衡点，这是可以计算出来的。
生物化学和分子生物学教授Michael Terns说：“这项研究的意义在于它对脱靶效应进行了系统和全面地分析，并且提出了减弱甚至消除脱靶效应的几种方法。”
最新研究结果表明，增长RNA链可以提高RNA的结合效率。所以张峰教授和他的同事们对RNA片段的结构进行了优化。张峰教授说，经过优化的RNA片段包含稳定的发卡结构，能够更有效的引导Cas9发挥作用。
张峰教授团队下一步的研究计划是，进一步提高CRISPR-Cas系统的特异性，并建立用来研究大脑神经回路的细胞系和动物。通过破坏参与大脑神经回路形成和发育的基因，探究其是如何发挥作用以及在神经系统疾病中是如何受损的。
革命性的意义
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞(包括iPS)的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。
由于解决了CRISPR-Cas系统脱靶效应的问题，该技术可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。
