细胞原代培养实验——胰酶消化法
细胞原代培养可以：（1）为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段；（2）为传代培养创造条件；（3）服务于临床实践，用于药物筛选等。
| 实验方法原理 | 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
|
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、实验材料准备 1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank's液可以高压灭菌。4℃下保存。
2. 用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5x105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 展开 |
| 注意事项 | 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 4. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 7. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 9. 吸溶液的吸管等不能混用。 展开 |
