小鼠肝细胞原代培养实验——胰酶消化法
小鼠肝细胞原代培养可用于：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因治疗研究。
| 实验方法原理 | 将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。 2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 3. 用手术剪将脏器剪成小块（大小约1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心（1 000 rpm，5 min）。 4. 视组织或细胞量加入5-6倍（3-5 ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。 6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 7. 再次离心5 min，弃上清液。 8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9. 加入含血清的培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。 展开 |
| 注意事项 | 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。 4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。 8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 9. 吸溶液的吸管等不能混用。 展开 |
