流式细胞仪对疟疾入侵的分型检测
实验步骤
根据选择的DNA染料选择对目标红细胞的荧光标记，这本身就取决于流式细胞仪在入侵检测分析结束时获得的数据，CFDA SE的荧光发射峰约为517nm，接近520nm处SYBR Green I的荧光。CFDASE可以与Hoechst 33342组合使用，DDAO SE 的荧光发射峰接近657nm。因此，它可以与Hoechst 33342或SYBR Green I组合使用。
1．加入12mL RPMI 1640和0.5mL水洗红细胞到50mL管中轻轻混匀，获得2％比容的血细胞和。
2．将3mL 2％比容红细胞悬浮液转移到15mL标有“染色红细胞 ”的管中，离心3分钟。
4．加入3.1mL 的RPMI 1640到15mL标有“CFDA的”管（或“DDAO”）。
5．加入12.4μL含5mM CFDA SE的二甲基亚砜（或6.2μL5mM DDAO SE的二甲基亚砜）至“CFDA” 管（或“DDAO”）获得20μM混悬溶液（或10μM），然后混合。
6．加入3 mL 20μMCFDA SE（或10μM DDAO SE）至“染色红细胞 ”管，并立即上下吹吸使得溶液混合。
7．将试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育2h。
14．将试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育2h。
21．加入3 mL不完全培养基，并吸取和悬浮细胞沉淀。
1．从“染色红细胞”试管中吸取400μL细胞悬液转移到标记“A”到“F”的离心管中。
2．加入含1U/mL神经氨酸苷酶的RPMI 1640 溶液8μL管B和管E 。
3．将6个试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育1h。
6．加入400μL不完全培养基至6个试管中用台式微量离心机离心30s。
9．加入2μL 10mg/ml蛋白酶0至C试管，加入40μL 10mg/ml蛋白酶至D、E试管，40μL 10mg/ml的糜蛋白酶至管F。
10．将6个试管放置在震荡仪上，旋转开关，以最大的速度在37°C培育1h。
13．加入400μL不完全培养基至6个试管中用台式微量离心机离心30s。
16．加入400μL不完全培养基，吹打细胞，悬浮颗粒。
3．加入50μL donor pRBC至2％比容，1-2％的原虫血症至18孔标记的细胞板，并标记为A1至F3。
5．加入50μL 目标红细胞至2％比容至相应的孔。（如从离心管中吸取50μL到每个孔A1，A2和A3）6．小心翼翼地取向上和向下吹吸18孔的混合溶液，避免气泡。
7．取出培养板，加入1％O2 ，3％二氧化碳平衡氮气3分钟。
如果目标红细胞用CFDA SE进行染色，寄生虫染色必须用Hoechst 33342。如果目标红细胞染色用DDAO SE，根据流式细胞仪上的激光线，染色寄生虫可用Hoechst 33342或SYBR Green 1 。
2．吸取并弃掉18孔50μL 培养上清液并标记为A1至F3。
5．加入200μL含 2％paraformaldehyde/0.2％戊二醛的PBS，重悬浮细胞沉淀，在4℃的孵育1h 。6．离心3分。重悬浮细胞沉淀。
9．18孔，每孔加入200μL含0.3％Triton X-100 的PBS，重悬浮细胞沉淀，室温孵育10分钟。11．离心3分钟。
13．18孔，每孔加入200μL含0.5mg/ml核糖核酸的PBS，重悬浮细胞沉淀，37°C孵育1h。16℃离心3分钟。
17．18孔，每孔加入200μL 1：5,000的 SYBR Green I，重悬浮细胞沉淀，37°C孵育1小时。
23．18孔，每孔加入200μL PBS，重悬浮细胞颗粒。
3．从18孔中吸取25μL染色细胞进行入侵检测，再把它加入新的培养板中只包含PBS。
5．采集能在流式细胞仪上产生适当激光线的稀释的细胞悬液，进行荧光标记和DNA染料选择（获得10万事件最低得到50000靶细胞进行分析）。
