胶体金免疫层析法对抗幽门螺杆菌相关蛋白...
实验概要
本实验建立一种快速、简易的检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白A(CagA)抗体的胶体金免疫层析法(GICA)。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，将重组的CagA抗原划线固定于硝酸纤维素膜上，制成免疫层析检测试条。 血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。
实验原理
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
主要试剂
1. 氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)
2. 葡萄球菌A蛋白(SPA)
3. 细胞毒素相关蛋白A(CagA)
4. 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗CagA-IgG试剂盒
主要设备
1. Z 323 K低温高速离心机
2. LGJ 0.5-Ⅱ冷冻干燥机
3. 点膜器
实验材料
血清标本
实验步骤
1. 15 nm胶体金的制备
其步骤为：去离子水溶解氯金酸使其终浓度为0.2 g/ L，煮沸后每100 mL加入10 g/ L柠檬酸三钠水溶液4 mL，继续煮沸7min. 电镜观察胶体金的粒度。
2. 免疫胶体金的制备
取颗粒直径为15 nm的胶体金100 mL，用0.1 mol/ L K2CO3调至pH 6.2，在搅拌状态下加入SPA(1 g/ L) 0.6 mL，继续搅拌10min；加入50 g/ L BSA 10 mL，继续搅拌5min. 4℃下3000 r/ min离心5min，弃沉淀，上清液以12 000 r/ min离心15min，小心移去上清液，沉淀即为制备的胶体金。用20 mL悬浮液悬浮沉淀，以吸水纤维吸附后冷冻干燥4 h，4℃保存备用。
3. 免疫层析测试条的制备
测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分附着有胶体金免疫复合物；在硝酸纤维素膜上用CagA(1.5 mg/ L)及人IgG(1 mg/ L)划线(1 mm宽)，分别作为检测线和对照线，晾干，用50 g/ L BSA封闭2 h，以0.01 mol/ L PBS洗涤3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5 cm×10 cm的试条，加干燥剂密封保存。
4. 抗Hp-CagA IgG的检测以新鲜血清为佳。 试管中加入0.1 mL～0.2 mL血清，将测试条含有金标记物的一端插入血清内即可。结果判定：以测试条硝酸纤维素膜上出现两条红色条带为抗Hp-CagA IgG阳性；仅出现一条红色条带(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性。如果无红色条带出现则视为试剂失效。结果确定时间：强阳性标本在5min内即可在检测线处见到红色胶体金颗粒聚集；弱阳性标本约需要10min确定结果。
-
焦点事件
