分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

利用单细胞打印机提高单克隆效率和可靠性的有效方案

2021.3.01

单细胞的分离具有非常广泛的应用，抗体药物的研发和生产、单细胞基因组学到细胞系的开发。然而面对单细胞克隆分离日益增长的实验需求，目前常用的方法或从效率方面，或者从可靠性方面并不尽人意：传统的有限稀释法基于泊松分布，依赖于统计概率，工作量大且效率低下；基于流式细胞术的单细胞分选更是由于其低的细胞复苏率而被诟病，其次仪器使用还要受累于严格的培训，繁复的清洗和维护工作。尽管如此，这两种方法都不能从分离的过程中即得到单细胞来源的证明，只能单纯依赖孔板扫描成像设备对结果拍照以后才能获得克隆单细胞来源证据。

Cytena Single-Cell Printer是一款非常高效的单细胞分离设备，通过Cytena SCP分离单细胞不仅能够有高的单细胞获得率，获得的单细胞的生长率也非常高，仪器通过优异的光学系统，能够对每个成功被获得的单细胞在分离的过程中跟踪拍照，留下单细胞来源的证据，结合孔板扫描设备成像结果，相互佐证单细胞来源，可以使单细胞可靠性高达99.9%。机器使用一次性的耗材，免去了大量的清洗和验证工作，操作简单，无需复杂维护。

下文中介绍了一种单细胞打印机结合孔板成像的实验流程，实验中使用有限稀释法作平行对照，证明仪器的高效可靠性。

材料和方法：

样品准备：
指数生长期的CHO-K1 细胞 (来源于ATCC)，轻柔离心去除培养基后，重悬于无菌PBS溶液中，密度调整为1x10⁶cell/mL，为避免细胞团块儿，在上样至打印芯片前，通过40um筛网过滤(其他类型细胞处理方法相同)。

Cytena SCP单细胞打印分离：
上样：取准备好的细胞样品60ul加入一次性无菌打印芯片中，芯片安装好即可以启动打印过程。
参数设定：在开始打印前可以设定目标单细胞的圆度，直径和荧光信号强度范围（F.sight），因为濒死细胞或不健康细胞的直径和圆度通常会发生变化，此功能能够提高获得优质单细胞的概率（见图1）。如果对细胞的大小圆度或者荧光强度不熟悉，仪器还提供样品数据收集分析功能，可以简单快速的获得样品数据的分布情况，以指导设置合适的参数区间。

图1

图2

单细胞分离：仪器使用获得ZL的类似喷墨的柔和分液系统产生均匀液滴，使用双摄像头系统分别对液滴进行质控和液滴中的细胞进行甄选（F.sight 中的荧光检测的功能可以对液滴中细胞的荧光强度进行检测），快速分离到符合要求的单细胞（图2）至铺有克隆培养基的384孔板中（仪器也支持96孔板）。
分离的单细胞来源证据: 在对细胞分离筛选的过程中，对于每一个被获得的单细胞，在其靠近喷嘴区，系统确认单细胞事件，即对其进行靠近-进入ROI区域-通过喷嘴区的过程进行跟踪拍照，留下单细胞源证据（图3）。后续多孔板在经过孔板成像设备扫描成像后可以与此图片证据相互佐证，验证单细胞的准确性。

图3
有限稀释对照：
取准备好的细胞样品，通过细胞计数仪计数后，使用克隆培养基进行系列稀释，接种密度为0.3cell/孔，在384孔板中接种80ul细胞稀释液。

结果统计与分析：

使用多孔板成像设备在Day0拍照统计单细胞打印机分离获得的单细胞率数据，之后进行跟踪拍照至7天后肉眼可见的克隆团出现，统计单克隆生长率。

单细胞率：
使用同一个打印芯片，分了两个384孔板，平均的单细胞率为92.6%，两细胞孔和空孔率分别为5.0% and 0.4%（见图4）,分完每板所用的时间平均为20min。

图4
克隆生长率：
分离得到的单细胞的分裂生长能力是很关键的数据，体现细胞在经过分离过程以后的活力情况，可以验证分离的方法是否对细胞产生了负面影响，有限稀释法被认为是对细胞的影响最小的单细胞分离方法。单细胞打印机分选的细胞生长情况（图5A）：326个孔含有单细胞克隆，5个孔是两个细胞来源的克隆，32个孔没有细胞。有限稀释法的多孔板铺板后生长到第7天的克隆生长情况（图5B）：44个孔是单细胞克隆孔，6个孔是多个细胞的克隆孔，334孔是空细胞孔。单细胞打印机分离的单克隆生长率高达84.6%，远远高于平行的有限稀释法（10.5%）（分裂生长的单克隆数/总的单细胞孔数*100%）。