ELISA 测定过程
1、加样
在 ELISA 中,除了包被外,一般需要进行4～5次加样。加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴的构造特殊,导致清洗困难,加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出。
2、保温
在建立 ELISA 方法时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1～2h,产物的生成可达顶峰。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,反应板不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。注意温育的温度和时间应按规定力求准确。试剂盒温育是在空气浴中完成的,采用水浴会造成值偏高或花板。另外,温育中还有边缘效应,边上的值会偏高,建议为了客观的判断结果,将质控放在非边缘位置。96孔酶标板的结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格的要求,酶标板周围与内部孔升降温度的速率不同,造成周边与内部孔的结果差异;干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,减少受热不均,贴密封膜,防止污物浸入,待对照管显色适当时,即可终止酶反应。
3、洗涤
洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤,但决定着实验的成败。ELISA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在 ELISA 操作中,洗涤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液,各种试剂盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%～0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而降低试验的灵敏度。洗液需要稀释,应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水,电导率小于1.5μS/cm,洗液如果结晶应待其溶解后配制。洗涤条件的一致性较差,对结果的影响较大,防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果,血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”,造成假阳性或假阴性,所以操作洗板机的过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水清洗几遍。
ELISA 板的洗涤一般可采用以下方法:吸干孔内反应液;将洗涤液注满板孔;放置2min,略做摇动;吸干孔内液,也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次,有时甚至需洗5～6次。
4、比色
TMB 经 HRP 作用后,约 40min 显色达顶峰,随即逐渐减弱,至 2h 后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12～24h)不褪,是目前判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光度。酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15～30℃,使用前先预热仪器15～30min,测读结果更稳定。
测读数值时,要选用产物的敏感吸收峰,如 OPD 用 492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动 ELISA 板的位置,最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。肉眼判断结果时,显色浅不易观察,影响结果的准确性,必须使用酶标仪检测,以保证结果的一致性。
5、结果判定
(1)目测定性法:加入底物经酶解和终止反应后,肉眼观察阳性孔的颜色明显深于(竞争法则浅于)阴性对照;与阴性对照的颜色接近者,判定为阴性。
(2)直接以吸光度表示:吸光度越大,阳性反应越强,此数值是固定试验条件下得到的结果,而且每次都伴有参考标本。
(3)以 P/N 值(阳性孔 OD 值/阴性孔 OD 值)表示:P/N 大于或等于2.1为阳性;P/N 值小于2.1而大于1.5为可疑;P/N 小于1.5为阴性。
(4)定量测定结果可根据标准曲线计算样品中待测物的含量。
(5)以终点滴度表示:将标本稀释,最高稀释度仍出现阳性反应(即吸收值仍大于规定吸收值时),为该标本的滴度。
