将基因转移至未分化ES细胞实验

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将基因转移至未分化ES细胞实验

2019.11.12

ES细胞电穿孔
将ES克隆挑取到96孔板
分配96孔板上细胞用于冻存和体外分化
融化96孔板上的细胞

实验材料	线性化转移基因 DNA 未分化 ES 细胞
仪器、耗材	电穿孔仪和电穿孔杯 neoR-MEF 滋养板 ES 生长培养基
实验步骤	1. 准备下列试剂和材料：线性化转移基因 DNA（1 mg/ml，溶于无菌 TE）未分化 ES 细胞 Bio-Rad 电穿孔仪和电穿孔杯 100 mm neo^R-MEF 滋养板 ES 生长培养基含 300 μg/ml G418 的 ES 生长培养基 2. 收获未分化 ES 细胞，以 10⁷ /ml 悬于 ES 生长培养基。 3. 吸取无菌 DNA 加入电穿孔杯。加入 0.8 ml ES 细胞，轻轻吹吸混合，不要产生气泡。 4. 室温电穿孔 DNA/细胞混合物：250 μF，0.3 kV。 5. ES 生长培养基 1:10 稀释电穿孔细胞，接种 neo^R-MEF 滋养层，密度为 10⁶ 细胞/100 mm 滋养板。放于 37℃ 湿润的 5% CO₂ 温箱。 6. 接种 48 小时后，换含 300 μg/ml G418 的培养基。 7. 隔天换液。展开

实验材料

线性化转移基因 DNA 未分化 ES 细胞

仪器、耗材

电穿孔仪和电穿孔杯 neoR-MEF 滋养板 ES 生长培养基

实验步骤

1. 准备下列试剂和材料：

线性化转移基因 DNA（1 mg/ml，溶于无菌 TE）

未分化 ES 细胞

Bio-Rad 电穿孔仪和电穿孔杯

100 mm neo^R-MEF 滋养板

ES 生长培养基

含 300 μg/ml G418 的 ES 生长培养基

2. 收获未分化 ES 细胞，以 10⁷ /ml 悬于 ES 生长培养基。

3. 吸取无菌 DNA 加入电穿孔杯。加入 0.8 ml ES 细胞，轻轻吹吸混合，不要产生气泡。

4. 室温电穿孔 DNA/细胞混合物：250 μF，0.3 kV。

5. ES 生长培养基 1:10 稀释电穿孔细胞，接种 neo^R-MEF 滋养层，密度为 10⁶ 细胞/100 mm 滋养板。放于 37℃ 湿润的 5% CO₂ 温箱。

6. 接种 48 小时后，换含 300 μg/ml G418 的培养基。

7. 隔天换液。

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细胞基因转移 es 未分化

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