细胞消化的小技巧（一）
每个做细胞实验的人，不管去哪“浪”，
心里都会有个牵挂：
我的细胞
过两天要传代！
大部分组织细胞离体培养时，会以贴壁的形式生长（除了取自血、脾或骨髓的细胞）;完全培养基中的血清，含有许多带阳性电荷的促细胞附着因子（层黏连蛋白 Laminine、纤维链接蛋白 Fibronectin 等胞外基质），能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上（玻璃或塑料培养容器），并形成键结、贴壁伸展。
▲ 阳性电荷的促细胞附着因子，能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上
所以当细胞长满需要分盘的时后，就要想办法让细胞和培养底物说 再见！也就是所谓的～
细胞消化Cell Detachment
常见细胞消化法有以下三种：
物理机械法 离子螯合法 酶消化法
❂ 物理机械法
直接用液体吹打或用刮刀，施予外力让细胞与培养底物分离；适用于贴壁性弱的细胞传代，但相较于其它消化方法，这种外力无法量化控制，细胞分散效果差，且可能会造成大量细胞破损，使内容物释放到培养基，进而影响细胞传代状态。
▲细胞刮勺
❂ 离子螯合法
细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结，当然也包含各种黏附蛋白（例：整合素、钙黏着蛋白、桥粒等），螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下，抽离这些离子，使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用，让细胞较容易在施予外力时，脱离培养底物并促进细胞分散。
0.02% EDTA是细胞传代最常用的离子螯合剂，在37℃作用效果最佳（消化较敏感的细胞可在4℃作用），适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。
但EDTA无法用血清终止其反应，所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液（如：PBS）清洗离心，以免影响后续细胞贴盘效果。
▲ EDTA（黑）能螯合二价离子（红）
❂ 酶消化法
用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质，适用于消化贴壁性稍强的细胞。
目前常用蛋白水解酶主要有两种：
胰蛋白酶（Trypsin）
为一种来自于胰腺的丝氨酸蛋白酶；能辨识并剪切胜肽链中的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）羧基端（两者之一紧跟脯氨酸状况除外），所以能直接作用在细胞外的黏附蛋白及胞外基质上，但如果作用时间过长，细胞膜上內嵌的其他蛋白也会被水解，导致细胞膜受损；不同细胞适合的胰蛋白酶使用浓度及作用时间都各有不同。
使用胰蛋白酶消化前，请先用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，因为血清中的抗凝血酶III及平衡盐溶液中的钙、镁离子，都会降低胰蛋白酶活性，导致消化效果不佳；消化完毕后，可直接用含血清的培养基或其他胰蛋白酶抑制剂终止消化反应。
胶原酶（Collagenase）
为一种胶原水解酶，大多由细菌提取而来；能辨识并剪切Pro-X-Gly-Pro胜肽序列，而此序列在胞外基质主成分-胶原蛋白中出现的频率比一般蛋白高很多，使得胶原酶能较专一的作用在胞外基质上，所以对细胞的伤害比胰蛋白酶小，且在钙、镁离子环境中仍有活性，可用PBS和含血清的培养液配制，操作简便，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。
细胞还是不愿意跟底物说再见！咋办？
面对贴壁性极强的细胞，可进一步使用 含EDTA的胰蛋白酶 来消化细胞，EDTA会抓住细胞表面未洗净的钙、镁离子，降低黏附蛋白活性使细胞不会彼此粘黏，同时让胰蛋白酶在不受钙、镁离子干扰下发挥最大作用剪切胞外基质及黏附蛋白，让细胞顺利脱离培养底物且减少细胞成团现象。
