使用Azurespot分析软件定量非磷酸化与磷酸化蛋白
在上期我们回顾了使用多重来成像磷酸化蛋白的技巧，在这部分中，我们将介绍使用Azurespot分析软件进行定量。
背景去除
背景扣除对于有效定量是必不可少的。 例如，AzureSpot有五个自动后台选项和三个手动选项。
> 如果背景不均匀，请使用 Rolling Ball。 类似指定半径的圆盘在泳道轮廓下“滚动”，对信号求平均，从而产生平滑小的变化。 半径越大，滚动越平滑。
> 如果轮廓的末端与轮廓的其余部分没有太大差异，请使用Rubber Band。 这种方法就像在泳道轮廓下拉伸橡皮筋一样。谨慎使用此方法，在泳道边缘找到最低点，绘制泳道稍微不同，值就会发生变化。通常，这种计算方法很难做重复分析。
> 如果您已经执行了条带检测，则可以使用Valley to Valley，它使用每个条带的边缘来确定和减去背景。 输入最大斜率非常重要，以避免将重叠条带之间的边缘识别为背景。
> Minimum Profile方法是将最小值将设置为背景
> LaneEdge Subtraction使用每个泳道边缘的两个值中的较低值作为背景。
归一化
AzureSpot可以通过三种方式执行归一化。 首先，它可以设置标准凝胶中泳道中特定条带的归一化。 在多重凝胶中，它可以用看家蛋白或总蛋白质归一化。
总蛋白归一化（TPN）变得越来越普遍，因为它具有更高的准确性和对定量蛋白印迹的适应性。 如果您已经验证了您的看家蛋白的表达没有改变，那么它可能是合适的。 否则，TPN是首选。
在转印后免疫检测之前用总蛋白质染剂（例如AzureRed荧光总蛋白染剂）染膜。 该方法不依赖于抗体，并且考虑了样品蛋白质加载和转移效率的变化。
不要忘记使用稀释系列来确认线性检测范围，这可确保信号强度与样品量成正比
AzureSpot执行归一化。 紫色线始终是背景，绿色线之上将是信号。 首先选择一条泳道作为参考泳道（或标准化标准）。 对于每个泳道，计算归一化因子即泳道中所有条带的灰度值除以参考泳道中的所有条带的灰度值。 接下来计算所有通道中的归一化值，即条带的原始灰度值除以归一化因子。
(LNF:归一化因子 TPS:总蛋白染色)
在整个凝胶上加入相同量的蛋白质样品。 蛋白质浓度测定可以帮助确定是否需要调整浓度。
Examples of signal intensity for different proteins at different concentrations (Ghosh, et al. 2014
在归一化之前确保您的上样量处于线性动态范围内，此范围因浓度而异
通过有效的背景扣除和总蛋白归一化，您将可对磷酸化蛋白进行有效的定量分析。
