磷酸化位点分析实验-磷酸化位点的确定
实验方法原理 磷酸化位点的确定也使用一些通用方法；磷酸化蛋白质被纯化，如果可能蛋白质要均一；磷蛋白被特异性的化学或酶反应切断、产生肽混合物，其中含有一到两个磷酸肽不同之处在干其分离磷酸肽的策略是为了确定氨基酸序列，定位肽段内磷酸化的残基。上面所述的分离方法， 2D-PP 作图、 HPLC 或 lMAC 方法，也同样适宜于微量制备磷酸肽用于确定磷酸化位点。
实验材料 蛋白样品
实验步骤
过去确定磷酸化位点测序最常用的是逐步化学降解法，如丝氨酸和苏氨酸磷酸化分析方法、酪氨酸磷酸化分析方法, 最近，此方法已经主要被质谱方法所取代 。非放射活性和放射活性磷酸肽测序的方法，这两种方法可以补充．在某些情况下可以替代质谱方法来确定磷酸化位点。非放射活性方法是用于检测磷酸丝氨酸和磷酸苏氨胺，包括β-消除，与巯基乙醇反应形成s- 乙基化半胱氨酸或β-甲基-s-乙基半胱氨酸，它们很容易以 PTH 衍生物的形式从自动测序仪中提取出来。放射活性方法是由 Ceerenkov 计数检测器检测在 Edman 化学降解测序僻环中释放出的放射性活度。如果测丝氨酸或苏氨酸磷酸盐残基，磷酸盐被除去，可观察到32p-磷酸盐和各自的 PTH衍生物。在酪氨酸磷酸盐情况下，磷酸酯键更稳定，分析的提取物是 PTH 磷酸酪氨酸。如果得到的磷酸肽的量非常有限，也许不可能用化学降解法测肽序列，但是在降解循环后，放射活性从肽中释放，通常有可能确定肽内磷酸化位点。
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