当外泌体遇上环状RNA（四）
（3）GC来源的外泌体circSHKBP1在体外能促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭
为了探索circSHKBP1是否影响GC细胞的生物学过程，分析了circSHKBP1在4种人GC细胞系（BGC823、HGC27、AGS和MGC803）和正常胃上皮细胞系GES1中的表达水平。结果表明，circSHKBP1在4个GC细胞系中均高表达。此外，来自BGC823细胞培养基的外泌体circSHKBP1在GC细胞系中也存在过表达。随后，以circSHKBP1反向剪接序列的siRNA来敲低circSHKBP1，用pcDNA3.1-CMV-circRNA载体构建circSHKBP1过表达质粒。CCK8和EdU检测和Transwell检测显示，沉默circSHKBP1显
著抑
制GC细胞增殖、迁移和侵袭能力而过表达circSHKBP1则相反。此外，作者从转染了circSHKBP1质粒的BGC823和HGC27细胞培养液中提取外泌体，与未处理的GC细胞共培养。结果表明，外泌体circSHKBP1的过表达也影响了GC细胞的增殖、迁移和侵袭。综上所述，过circSHKBP1能促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭并且随着circSHKBP1在GC细胞中的表达，更多的circSHKBP1通过外泌体中干扰其他GC细胞的生物学功能。
（4）circSHKBP1可通过海绵机制吸附miR-582-3p
鉴于circRNA海绵吸附miRNA的作用已被广 泛研究，且circSHKBP1在胞质中含量丰富，作者探索了circSHKBP1是否通过作为miRNA的海绵分子来发挥生物学功能。对BGC823细胞中的AGO2进行RIP，结果显示内源性circSHKBP1特异性地富集于AGO2。使用CircInteractome预测可以与circSHKBP1结合的潜在miRNA分子（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458）。qPCR、RNA pull-down和双荧光素酶报告实验证实只有miR-582-3p可以直接与circSHKBP1互作。综上所述，circSHKBP1可以充当miR-582-3p的海绵分子并降低miR-582-3p的表达。随后作者将miR-582-3p单独转染或与circSHKBP1质粒共转染到GC细胞中。CCK8和Transwell分析表明，miR-582-3p会抑
制GC细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达circSHKBP1则消除了它对GC细胞生长的抑
制作用，这表明circSHKBP1是通过海绵吸附miR-582-3p来发挥的促ai作用。
（5）circSHKBP1通过上调HUR来促进VEGF的翻译
分析临床数据发现circSHKBP1高表达组的血管浸润率显 著较高。使用生信分析网站找到了miR-582-3p的下游靶标HUR和EIF2S1，它们是VEGF（促进内皮细胞增殖）信号通路的一部分。WB分析显示，过表达circSHKBP1会促进HUR和VEGF的表达，而对EIF2S1无影响。此外，miR-582-3p模拟物可以降低BGC823细胞中HUR和VEGF的表达。同样，敲低circSHKBP1下调了HUR和VEGF，随后导入miR-582-3p抑
制剂可以恢复HUR和VEGF的表达水平。HUR的RIP实验证实，它可以与VEGF
mRNA和miR-582-3p直接结合。检测GC组织中HUR
mRNA的表达水平，发现HUR表达与miR-582-3p表达呈负相关，与circSHKBP1表达呈正相关。结果表明，circSHKBP1可以通过调节HUR来调控VEGF的表达。
