酶免疫技术基本原理及种类
酶联免疫技术和其他免疫技术一样,都是以抗体和抗原的特异性结合为基础的,其差别在于酶免疫方法以酶或者辅酶标记抗原或者抗体,用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应,使检测水平接近放射免疫测定法。酶免疫测定法可分为非均相免疫测定法和均相免疫测定法,非均相法又有固相法和液相法之分。实践中,常用的是非均相酶固相免疫测定法即 ELISA 法,该法将抗原或抗体结合到固相载体表面,将抗原或抗体相关物质与酶交联成酶结合物,一方面保持了与相应抗原或抗体结合的免疫特性,另一方面还具有酶活性。当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后,则形成酶标抗原-抗体复合物,复合物上的酶遇到相应底物时,可以催化产物水解、氧化或还原,从而产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度,即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在、数量多少,从而达到定性和定量测定的目的。ELISA 测定原理见图1-1。
图1-1 ELISA 测定原理示意图
在实际应用中 ELISA 技术主要有直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法、捕获包被法、ABS-ELISA 法、PCR-ELISA 法、A 蛋白酶联法、斑点免疫吸附法和组织印迹法等几种类型,下面主要介绍几种常用的方法,分别是直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法、捕获包被法。
1、直接法测抗原
(1)将受检抗原吸附于固相载体表面,洗涤除去其他未结合物质。
(2)加入酶标记的抗体,形成酶-抗体-抗原复合物,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(3)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。
试验中的一抗都得用酶标记,但不是每种抗体都适合作标记,费用相对提高。
2、间接法测抗体
(1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2)加受检抗体。标本中的抗体与固相抗原结合,形成固相抗体-抗原复合物。洗涤除去其他未结合物质。
(3)加酶标二抗。固相免疫复合物上的受检抗体与酶标二抗结合。彻底洗涤未结合的酶标二抗。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗体的量相关。
(4)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗体的量。
间接法的优势为:二抗可以加强信号,而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性;缺点为交互反应发生的概率很高。
3.双抗体夹心法检测抗原
(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)加受检抗原。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原-抗体复合物,洗涤除去其他未结合物质。
(3)加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合,彻底洗涤未结合的酶标抗体,此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
(4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。
这种双位点夹心法具有很高的特异性,常用于检测抗原。
4、竞争法测定抗原
(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)向待测管中加受检标本和一定量的酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量,洗涤。
(3)加底物显色。参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。
竞争法一般用于抗原中的杂质不容易去除,或者抗原的特异性差的情况下。
5、捕获包被法测定抗体
血清中针对某些抗原的特异性 IgM 常和特异性 IgG 同时存在,后者会干扰 IgM 抗体的测定。因此,测定 IgM抗体多用捕获法,先将所有血清 IgM(包括特异性 IgM 和非特异性 IgM)固定在固相上,在去除 IgG 后再测定特异性 IgM。
(1)将抗人 IgM 抗体连接在固相载体上,形成固相抗人 IgM,洗涤除去杂质。
(2)加入稀释的血清标本。血清中的 IgM 抗体被固相抗体捕获,洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
(3)加入特异性抗原试剂。它只与固相上的特异性 IgM 结合,洗涤。
(4)加入针对特异性的酶标抗体,使之与结合在固相上的抗原反应结合,洗涤。
(5)加底物显色,如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性 IgM 抗体存在,是为阳性反应。
