自然杀伤细胞和淋巴因子激活杀伤细胞的杀伤功能实验
实验方法原理 |
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中,能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞,无需抗原或有丝分裂原刺激,亦不依赖抗体或补体,在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。 |
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实验材料 | K562 LiBr |
试剂、试剂盒 | 3H-TdR 51Cr FCS RPMI1640 rHu IL-2 |
仪器、耗材 | 培养瓶 培养板 CO2孵箱 液闪仪 计数仪 |
实验步骤 |
一、效应细胞的制备
(2)取1×106细胞(0.5 ml),加Na251CrO4 100 μci,37 ℃孵育2~3 h,每15 min轻轻振摇一次
(3)用10 %FCS RPMI1640洗涤3 次,每次800 rpm,5 min
(4)重悬细胞浓度1×105 /ml
(5)96 孔V型或U型培养板中,每孔加100 μl(1×104细胞),每份3 个复孔 (6)每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100 μl,1 %TritonX-100;自然释放组加100 μl完全培养基
(7)200 g 离心1 min,37 ℃、CO2孵箱 4 h,200 g 离心1 min
(8)每孔取出100 μl上清,γ计数仪上测定cpm值
实验组cpm-自然释放cpm
特异性杀伤率(%)=─────────────
最大释放cpm-自然释放cpm
(2)37 ℃孵育2~3 h
(3)用10 %FCS RPMI1640洗涤3 次,每次800 rpm,5 min 调整细胞浓度为1×105 /ml
(4)96 孔U型或平底培养板中,每孔加100 μl(1×104细胞),每份3个复孔
(5)每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加100 μl 1%TritonX-100,自然释放组加100 μl完全培养基
(6)CO2孵箱培养18~24 h
(7)每孔吸出100 μl上清,加入胰蛋白酶(终浓度0.15 %)和DNA酶(终浓度为0.0125 %)
(8)继续孵育30 min
(9)用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上
(10)干燥后,移入液闪瓶中,加入1 ml闪烁液,β液闪仪中测cpm值
实验组cpm
特异性释放率(%)=(1- ────── )×100%
对照组cpm
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注意事项 |
1. 每次试验最好取3~4 个不同效应细胞/靶细胞比例,常用效靶比例为100∶1,50∶1,25∶1,12.5∶1。 (1)1个溶解单位(Lytic unit,LU)为一定效应细胞30 %溶解(杀伤)5×103靶细胞(K562)的水平。
(5)3周以内或超过3个月以上小鼠的NK水平一般很低。
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